Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第1期
· 4 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年1月

Tree scale：0.1 Trachemys scripta elegans

Mus Musculus Rattus norvegicus Tursiops truncatus

Gallus gallus
Ovis aries
Xenopus tropicalis

Camelus ferus
Ailuropoda melanoleuca
Sus scrofa
Canis lupus familiaris

Felis catus Homo sapiens
Equus caballus Sumatran orangutan Nomascus leucogenys Pan troglodytes

图1 不同物种F9基因系统进化树
Figure 1 Phylogenetic tree of F9 genes in different species

人猪 M Q R V N M I M A E S F G L I T I C L L G Y L L S A E C T V F L D H E N A N K I L N R P K R Y N S G K L E E F V Q G N L E R E C M E E KC S F E E A R E V F E N 80
M R R L N V I M A E S L G L V S I C L L G Y L L S A E C T V F L D R E N A T K I L H R P K R Y N S G K L E E F V R G N L E R E C I E E KC S F E E A R E V F E N 80
M R N I M A E S G L I C L L G Y L L S A E C T V F L D E N A K I L R P K R Y N S G K L E E F V G N L E R E C E E KC S F E E A R E V F E N
人猪
T E R T T E F W K Q Y V D G D Q C E S N P C L N G G S C K D D I N S Y E C W C P F G F E G K N C E L D V T C N I K N G R C E Q F C K N S A D N K V V C S C T E G 160
T E K T N E F W K Q Y V D G D Q C E P N P C L N G G L C K D D I N S Y E C W C Q V G F E G K N C E L D A T C N I K N G R C K Q F C K T GA D S K V L C S C T T G 160
T E T E F W K Q Y V D G D Q C E N P C L N G G C K D D I N S Y E C W C G F E G K N C E L D T C N I K N G R C Q F C K A D K V C S C T G
人猪 Y R L A E N Q K S C E P A V P F P C G R V S V S Q T S K L T R A E T V F P D V D Y V N S T E A E T I L D N I T Q S T Q S F N D F T R VV G G E D A K P G Q F P 240
Y R L A P D Q K S C E P A V P F P C GR V S V H S P T T L T R A E I I F S N M D Y E N S T E V E P I L D S L T E S N Q S S D D F I R I V G G E N A K P G Q F P 240
S
Y R L A Q K S C E P A V P F P C G L T R A E F D Y N S T E E I L D T S Q S D F R V G G E A K P G Q F P
人猪 W Q V V L N G K V D A F C G G S I V N E K W I V T A A H C V E T G V K I T V V A G E H N I E E T E H T E Q K R N V I R I I P H H N Y N AA I N K Y N H D I A L L 320
W Q V L L N G K I D A F C G G S I I N E K W VV T A A H C I E P G V K I T V V A G E Y N T E E T E P T E Q R R N V I R A I P H H S Y N A T V N K Y S H D I A L L 320
W Q V L N G K D A F C G G S I N E K W V T A A H C E G V K I T V V A G E N E E T E T E Q R N V I R I P H H Y N A N K Y H D I A L L
人猪 E L D E P L V L N S Y V T P I C I A DK E Y T N I F L K F G S G Y V S G W G R V F H K G R S A L V L Q Y L R V P L V D R A T C L R S T K F T I Y N N M F C A G F 400
E L D E P L T L N S Y V T P I C I A DK E Y T N I F L K F G S G Y V S G W G R V F N R G R S A T I L Q Y L K V P L V D R A T C L R S T K F T I Y S N M F C A G F 400
E L D E P L L N S Y V T P I C I A DK E Y T N I F L K F G S G Y V S G W G R V F G R S A L Q Y L V P L V D R A T C L R S T K F T I Y N M F C A G F
人猪 H E G G R D S C Q G D S G G P H V T E V E G T S F L T G I I S W G E E C A M K G K Y G I Y T K V R Y V N W I K E K T K L 460
H E G G K D S C Q G D S G G P H V T E V E G T S F L T G I I S W G E E C A V K G K Y G I Y T K V R Y V N W I K E K T K L 461
H E G G D S C Q G D S G G P H V T E V E G T S F L T G I I S W G E E C A K G K Y G I Y T K V R Y V N W I K E K T K L
人/猪FⅨ氨基酸序列的同源性分析。相同氨基酸用灰色阴影表示。
图2 人/猪FⅨ蛋白氨基酸序列的同源性分析
Figure 2 Homology analysis of amino acid sequence between human/pig FⅨ protein

2.3 F9基因CRISPR/Cas9靶向载体的构建 sgRNA 和抗性质粒 pHY54 SV40⁃neo 后，经过 G418
依据巴马猪F9基因第2外显子序列，利用在线 筛选，最终得到单细胞克隆共 55 个（表 2），其中有
工具设计2对sgRNA寡核苷酸序列（图4A），退火形 25个单细胞克隆发生基因突变，敲除率为45.5%；选
成双链后分别与线性化 pX330 载体连接（图 4B）。 用敲除号中状态较好的单细胞克隆进行冻存。
将连接产物转化至大肠杆菌 DH5α中，涂板后挑取
3 讨 论
单菌落进行摇菌，抽提质粒并送测序，测序结果（图
4C、D）表明sgRNA均已成功连接至pX330上。 血友病乙是一种与 X 染色体连锁有关的隐性
2.4 单细胞克隆的获得和鉴定 遗传性凝血功能障碍，主要因 F9 基因改变致血浆
［7］
野 生 巴 马 猪 胚 胎 成 纤 维 细 胞 转 染 pX330 ⁃ FⅨ活性缺乏 。大多数患者表现为自发性或轻微