Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第10期
               ·1350 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年10月


                  急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）           72 h 后在每孔中加入 10 μL CCK⁃8 溶液，注意防止
              是我国成人白血病中最常见的类型，在临床及遗传                            产生气泡，避光孵育 2 h 后用酶标仪测定 450 nm 处
              学上具有较强的异质性。标准剂量阿糖胞苷联合                             的吸光度，计算细胞生长抑制率。
              蒽环类药物的诱导方案明显改善了年轻 AML 患者                          1.2.3  细胞凋亡实验
              的预后，而老年AML患者的预后尚未显著改善                  ［1-3］ 。维        分别收集对照组和实验组1×10 个细胞，用预冷
                                                                                                6
              奈克拉（venetoclax，ABT⁃199）通过结合抗凋亡蛋白                  的 PBS 洗涤细胞 2 次，弃上清，加入 100 μL Binding
              BCL⁃2促进细胞凋亡，对AML 细胞有一定增殖抵抗                        Buffer 重 悬 细 胞 。 加 入 5 μL Annexin V⁃FITC 和
              作用，但同时需要联合其他药物治疗才能获得更深                            5 μL PI，轻轻吹匀，避光孵育 10 min 后加入 400 μL
              的缓解作用。地西他滨（decitabine，DAC）是一种胞                    Binding Buffer，轻轻混匀。染色后样品在1 h内用流
              苷类似物，属于去甲基化药物。较低药物浓度的地                            式细胞仪检测。Annexin V /PI 为活细胞，Annexin
                                                                                            -
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              西他滨可抑制 DNA 甲基转移酶，逆转 DNA 甲基化                       V /PI 为早期凋亡细胞，Annexin V /PI 为晚期凋亡
                                                                                                   +
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              状态，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。阿                            细胞。
              柔比星（aclarubicin，ACM）是一种蒽环类抗肿瘤药                    1.2.4  细胞周期实验
              物，通过抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ可干扰染色质的功                                分别收集对照组和实验组1×10 个细胞，离心，
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              能，同时影响线粒体功能。                                      弃上清，加入 1 mL 室温下的 PBS，将细胞悬液缓慢
                  多项临床试验证明ABT⁃199联合去甲基化药物                       加至3 mL 预冷的无水乙醇中，-20 ℃固定过夜。检
              治疗初诊老年 AML、复发难治性 AML 可显著改善                        测当天将固定细胞离心，弃乙醇，加入 3 mL 室温下
              患者预后 。DAC 联合 ACM 的方案（如 DCAG）治                     的 PBS，放置 15 min 使细胞水化。离心，弃上清，加
                       ［4］
              疗老年初诊 AML 患者 1 个疗程后的完全缓解（CR）                      入1 mL DNA染色液，涡旋振荡10 s混匀。室温避光
              率达 64.7%，明显改善老年 AML 患者的预后                 ［5-6］ 。  孵育 30 min。选择最低上样速度，在流式细胞仪上
              鉴于 ABT⁃199、DAC、ACM 在 AML 中显著的治疗作                  进行检测。
              用且可耐受，本研究将探索 ABT⁃199 联合 DAC、                      1.3  统计学方法
              ACM 对 AML 细胞增殖和凋亡的影响，为临床治疗                             所有实验至少重复 3 次。计量资料用均数±标
              AML提供基本理论依据。                                      准差（x ± s）表示。采用 GraphPad Prism 8 软件分析
                                                                数据和制作统计图。两组间比较采用t检验或单因
              1 材料和方法
                                                                素方差分析。采用 Compusyn 软件分析药物联合使
              1.1  材料                                           用的效果，联合指数CI < 1表示协同作用，CI=1表示
                  人AML细胞株HL60、KG⁃1细胞（上海中乔新舟                     相加作用，CI > 1表示拮抗作用。P < 0.05为差异有
              生物科技有限公司）；药物 ABT⁃199、DAC、ACM                      统计学意义。
             （MCE 公司，美国）；IMDM 培养液、胎牛血清（Gibco
                                                                2 结     果
              公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒（同仁化学试剂研究所，
              日本）；细胞凋亡检测试剂盒（南京诺唯赞公司）；细                          2.1  单药 ABT⁃199、DAC、ACM 对 AML 细胞增殖的
              胞周期检测试剂盒（杭州联科生物公司）。                               抑制作用
              1.2  方法                                                不同浓度的 ABT⁃199、DAC、ACM 分别作用于
              1.2.1  细胞培养                                       AML细胞（HL60、KG⁃1），72 h后检测3种药物对两株

                  人 AML 细胞株 HL60、KG⁃1 细胞培养于含 10%                细胞增殖的抑制作用。结果显示在一定的浓度范
              胎牛血清的IMDM培养液中，置于37 ℃、5% CO2、饱                     围里，随着药物浓度升高，细胞增殖抑制率也增
              和湿度培养箱中培养，隔天换液，实验时取对数生                            高。HL60 细胞对 ABT⁃199 相对敏感，KG⁃1 细胞对
              长期的细胞。                                            DAC 相对敏感，两种细胞对 ACM 都比较敏感。如
              1.2.2  CCK⁃8实验                                    图1所示，在HL60细胞中，ABT⁃199（20~80 nmol/L）
                  稀释不同浓度药物与细胞混合，使细胞终密度                          作用72 h后，细胞增殖抑制率为30.58%~60.30%；而
              为2×10 个/mL。将细胞接种于96孔板，每孔体系为                       在KG⁃1细胞中，ABT⁃199（200~800 nmol/L）作用 72 h
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              100 μL，同时设立空白组和对照组，每组 3 个复孔，                      后，细胞增殖抑制率为33.53%~52.66%。在HL60细
              96 孔板四周加入 PBS，置于细胞培养箱中培养。                         胞中，DAC（2 000~8 000 nmol/L）作用 72 h 后，细胞
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