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第42卷第10期
·1350 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年10月
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML) 72 h 后在每孔中加入 10 μL CCK⁃8 溶液,注意防止
是我国成人白血病中最常见的类型,在临床及遗传 产生气泡,避光孵育 2 h 后用酶标仪测定 450 nm 处
学上具有较强的异质性。标准剂量阿糖胞苷联合 的吸光度,计算细胞生长抑制率。
蒽环类药物的诱导方案明显改善了年轻 AML 患者 1.2.3 细胞凋亡实验
的预后,而老年AML患者的预后尚未显著改善 [1-3] 。维 分别收集对照组和实验组1×10 个细胞,用预冷
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奈克拉(venetoclax,ABT⁃199)通过结合抗凋亡蛋白 的 PBS 洗涤细胞 2 次,弃上清,加入 100 μL Binding
BCL⁃2促进细胞凋亡,对AML 细胞有一定增殖抵抗 Buffer 重 悬 细 胞 。 加 入 5 μL Annexin V⁃FITC 和
作用,但同时需要联合其他药物治疗才能获得更深 5 μL PI,轻轻吹匀,避光孵育 10 min 后加入 400 μL
的缓解作用。地西他滨(decitabine,DAC)是一种胞 Binding Buffer,轻轻混匀。染色后样品在1 h内用流
苷类似物,属于去甲基化药物。较低药物浓度的地 式细胞仪检测。Annexin V /PI 为活细胞,Annexin
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西他滨可抑制 DNA 甲基转移酶,逆转 DNA 甲基化 V /PI 为早期凋亡细胞,Annexin V /PI 为晚期凋亡
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状态,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。阿 细胞。
柔比星(aclarubicin,ACM)是一种蒽环类抗肿瘤药 1.2.4 细胞周期实验
物,通过抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ可干扰染色质的功 分别收集对照组和实验组1×10 个细胞,离心,
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能,同时影响线粒体功能。 弃上清,加入 1 mL 室温下的 PBS,将细胞悬液缓慢
多项临床试验证明ABT⁃199联合去甲基化药物 加至3 mL 预冷的无水乙醇中,-20 ℃固定过夜。检
治疗初诊老年 AML、复发难治性 AML 可显著改善 测当天将固定细胞离心,弃乙醇,加入 3 mL 室温下
患者预后 。DAC 联合 ACM 的方案(如 DCAG)治 的 PBS,放置 15 min 使细胞水化。离心,弃上清,加
[4]
疗老年初诊 AML 患者 1 个疗程后的完全缓解(CR) 入1 mL DNA染色液,涡旋振荡10 s混匀。室温避光
率达 64.7%,明显改善老年 AML 患者的预后 [5-6] 。 孵育 30 min。选择最低上样速度,在流式细胞仪上
鉴于 ABT⁃199、DAC、ACM 在 AML 中显著的治疗作 进行检测。
用且可耐受,本研究将探索 ABT⁃199 联合 DAC、 1.3 统计学方法
ACM 对 AML 细胞增殖和凋亡的影响,为临床治疗 所有实验至少重复 3 次。计量资料用均数±标
AML提供基本理论依据。 准差(x ± s)表示。采用 GraphPad Prism 8 软件分析
数据和制作统计图。两组间比较采用t检验或单因
1 材料和方法
素方差分析。采用 Compusyn 软件分析药物联合使
1.1 材料 用的效果,联合指数CI < 1表示协同作用,CI=1表示
人AML细胞株HL60、KG⁃1细胞(上海中乔新舟 相加作用,CI > 1表示拮抗作用。P < 0.05为差异有
生物科技有限公司);药物 ABT⁃199、DAC、ACM 统计学意义。
(MCE 公司,美国);IMDM 培养液、胎牛血清(Gibco
2 结 果
公司,美国);CCK⁃8 试剂盒(同仁化学试剂研究所,
日本);细胞凋亡检测试剂盒(南京诺唯赞公司);细 2.1 单药 ABT⁃199、DAC、ACM 对 AML 细胞增殖的
胞周期检测试剂盒(杭州联科生物公司)。 抑制作用
1.2 方法 不同浓度的 ABT⁃199、DAC、ACM 分别作用于
1.2.1 细胞培养 AML细胞(HL60、KG⁃1),72 h后检测3种药物对两株
人 AML 细胞株 HL60、KG⁃1 细胞培养于含 10% 细胞增殖的抑制作用。结果显示在一定的浓度范
胎牛血清的IMDM培养液中,置于37 ℃、5% CO2、饱 围里,随着药物浓度升高,细胞增殖抑制率也增
和湿度培养箱中培养,隔天换液,实验时取对数生 高。HL60 细胞对 ABT⁃199 相对敏感,KG⁃1 细胞对
长期的细胞。 DAC 相对敏感,两种细胞对 ACM 都比较敏感。如
1.2.2 CCK⁃8实验 图1所示,在HL60细胞中,ABT⁃199(20~80 nmol/L)
稀释不同浓度药物与细胞混合,使细胞终密度 作用72 h后,细胞增殖抑制率为30.58%~60.30%;而
为2×10 个/mL。将细胞接种于96孔板,每孔体系为 在KG⁃1细胞中,ABT⁃199(200~800 nmol/L)作用 72 h
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100 μL,同时设立空白组和对照组,每组 3 个复孔, 后,细胞增殖抑制率为33.53%~52.66%。在HL60细
96 孔板四周加入 PBS,置于细胞培养箱中培养。 胞中,DAC(2 000~8 000 nmol/L)作用 72 h 后,细胞