Page 18 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 18

第42卷第4期
               ·468 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年4月


              究中心提供［许可证号：SCXK（沪）20130006］。饲养
                                                                           E
              于东南大学实验动物中心，室温保持20~25 ℃，湿度                                                             H
                                                                                                         A1
             （55±10）%，昼夜明暗交替时间10~14 h，噪音< 60 dB，                              F
                                                                             G
              大鼠自由饮食和饮水。动物购买后在实验前分笼
                                                                                         D
              适应实验室环境饲养1周，4只/笼，期间统一适应性
                                                                                      B      C           A2
              跑台训练5 d，每天10 min。所有动物实验均经东南
              大 学 实 验 动 物 福 利 伦 理 委 员 会 批 准（伦 理 号 ：
              20200406021）。
              1.1.2  主要材料和试剂
                  HUVEC 由东南大学医学院心血管病研究所                             储液槽
              提供。ECM 培养基（Sciencell 公司，美国），胰酶
             （Hyclone公司，美国），胎牛血清（杭州四季青公司），
                                                                                       平板流动腔
              人重组 BDNF（human recombinant brain⁃derived neu⁃                                         蠕动泵
              rotrophic factor，rhBDNF）（Proteintech 公司，美国），
                                                                        图1 平行板流动小室系统（循环流体）
              羊抗 BDNF 多克隆抗体、兔抗 TrkB 多克隆抗体、兔                      Figure 1 Parallel plate flow cell system（circulating flow）
              抗 TrkB（phospho Y515）多克隆抗体、β⁃actin 多克隆
                                                                                                  2
              抗体（Abcam 公司，英国），抗羊二抗（Thermo Fisher                高度）。本实验中η=0.765 1 dyn/cm ，W=2.57 cm，
              Scientific 公司，美国），兔抗 CD34 多克隆抗体、兔抗                H=0.04 cm，SS=12 dyn/cm ，Q=0.050 7 mL/s。
                                                                                       2
              Akt多克隆抗体、兔抗磷酸化Akt多克隆抗体（Sigma                           流体剪切力的加载：载玻片经高压消毒灭菌
              ⁃Aldrich 公司，美国），抗兔二抗（北京中衫金桥生物                     后，放入超净台中风干，并使用 0.2%多聚赖氨酸包
              技术有限公司），羊抗兔 FITC（Proteintech 公司，美                 被。将包被好的载玻片用 PBS 清洗 3 遍，再将培养
              国），即用型免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开                           至第 2~5 代的细胞接种于载玻片上，放入培养皿，
              发有限公司），DAB显色试剂盒（北京中衫金桥生物                          静置2 h待细胞贴壁后，往培养皿中加入培养基，置
              技术有限公司），BDNF检测试剂盒（R&D Systems公                    于培养箱中继续培养待细胞长满 80%后部分继续
              司，美国），Transwell 小室（Corning 公司，美国），                静止培养，取出置于流室系统中进行实验。流室
              Matrigel 基质胶（BD Bioscience 公司，美国），平行板             系统装备完善后，在储液槽中加入ECM培养基，开
              流动小室（华西医学中心生物工程研究室），动物跑                           启蠕动泵，产生 LSS 作用于 HUVEC；LSS 分别由非
              步机（成都泰盟软件有限公司）。                                   循环流体、循环流体、循环流体加入人重组 BDNF
              1.2  方法                                           （50 ng/mL） 产生。
                                                                          ［8］
              1.2.1  流室系统装配和细胞干预                                1.2.2  ELISA检测循环流体BDNF浓度
                  系统装配：本系统由流室系统和灌流系统两部                               收集 LSS 干预 0、15、30、60 min 时段的循环流
              分组成，包括蠕动泵、流室、储液槽和医用硅胶管道                           体。96 孔板前 2 列为标准曲线孔，按照试剂盒说明
              等（图1）。蠕动泵为本系统提供稳定的常定流。流                           书给出的浓度使用标准品稀释液稀释相应标准品；
              室系统是由有机玻璃制成的盒装结构（包括流入                             按照 1∶4加入样品稀释液稀释样品100 μL/孔，室温
              仓、剪切力发生仓和流出仓），为保证流动液以均匀                           孵育过夜。严格按照试剂盒说明书检测各时段循
              速度通过相同缝隙流入发生仓，两端的流入仓和流                            环流体中BDNF的浓度。
              出仓分别外接灌流系统。灌流液以固定流量由蠕                             1.2.3  Western blot检测蛋白表达及磷酸化水平
              动泵泵出后经管道进入流室系统而对HUVEC 施加                               在 LSS 干预的 0、15、30、60 min 检测 BDNF、
              剪切力，后经管道流回储液槽，灌流液循环利用。                            TrkB 蛋白表达及 TrkB、Akt 磷酸化水平。细胞裂解
              也可在流入、流出口分别放置储液槽，一端提供新                            液提取各组细胞样本总蛋白，采用BCA法对蛋白含
              鲜培养液，一端接收流出液，灌流液非循环利用。                            量进行定量检测。与上样缓冲液按比例混合均匀
                  流量流速计算：剪切力 SS 与流量 Q、流室尺寸                      后煮沸 5 min，进行 SDS⁃PAGE 凝胶电泳后转膜，5%
              之间的计算公式为 SS=6ηQ/WH（η为灌流液的黏                        脱脂奶粉溶液常温封闭1 h，分别加入1∶200稀释的
                                           2
              度，Q 为循环液的流量，W 为流室宽度，H 为流室                         抗 BDNF、1∶50 稀释的抗 TrkB、1∶50 稀释的抗 TrkB
   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23