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第42卷第4期 侯黎光，叶 宇，苟惠清，等. A20通过抑制自噬缓解实验性牙周炎牙槽骨吸收［J］.
2022年4月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（4）：476-483，587 ·477 ·
regulation of autophagy，and A20 is expected to be a new target for periodontitis treatment.
［Key words］ A20；autophagy；experimental periodontitis；alveolar bone
［J Nanjing Med Univ，2022，42（04）：476⁃483，587］
牙周炎是以牙周组织炎症及牙槽骨吸收为特 相关病毒（adeno⁃associated virus，AAV）（AAV⁃A20），
征的慢性炎症性疾病，最终导致牙齿松动及丧失。 探索 A20 过表达对小鼠实验性牙周炎的治疗作用。
菌斑为牙周炎的始动因素，可诱发牙周组织免疫炎 此外，通过检测小鼠牙周组织自噬相关因子的表达
［1］
症反应扰乱骨稳态 。牙龈卟啉单胞菌（Porphy⁃ 变化，明确自噬在 A20 对实验性牙周炎调控中的作
romonas gingivalis，P. gingivalis）为牙周炎的主要致 用。结果表明 A20 通过负向调控自噬，抑制破骨细
［2］
病菌 。成骨和破骨之间的平衡是维持牙槽骨稳态 胞分化，缓解小鼠实验性牙周炎牙槽骨吸收，有望
的关键。当牙周组织出现炎症时，由于破骨细胞过 成为牙周炎治疗的新靶点。
［3］
度激活，倾向于发生骨吸收 。 1 材料和方法
泛素编辑酶 A20，又称肿瘤坏死因子⁃α诱导蛋
白 3（tumour necrosis factor⁃alpha⁃induced protein 3， 1.1 材料
TNFAIP3），为炎症反应和自身免疫性疾病的关键调 SPF 级 C57BL/6J 小鼠（雄性，6~8 周，体重 20~
节分子 。A20可基于核因子⁃κB（nuclear factor⁃κВ， 25 g）购自南京医科大学实验动物中心。本研究经
［4］
NF⁃κB）通路抑制 P. gingivalis 刺激的巨噬细胞及牙 南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准（伦理
龈角化细胞炎症因子释放及牙龈角化细胞凋亡 ［5-6］ 。 批件编号：IACUC⁃2007035）。AAV⁃A20及阴性对照
与野生型小鼠相比，丝线结扎可诱导 A20 基因半敲 AAV 由上海吉凯公司构建及生产。P. gingivalis
［5］
除小鼠出现更为严重的牙槽骨吸收 。以上研究表 （ATCC 33277）由南京医科大学江苏省口腔疾病研
明，A20参与调控牙周组织炎症与骨代谢，但其潜在 究重点实验室提供。
机制尚未完全明确。 兔抗小鼠 A20 抗体、兔抗小鼠 LC3B 抗体（SAB
自噬是维持细胞稳态的过程，可将错误折叠蛋 公司，美国），Cy3 标记山羊抗兔 IgG（H+L）、DAPI 染
白、受损细胞器运送至溶酶体降解并且回收利用产 色液、苏木素伊红（haematoxylin and eosin，HE）染色
［7］
物 。自噬功能异常与神经退行性疾病、癌症、糖尿 试剂盒（上海碧云天公司），抗酒石酸酸性磷酸酶
［8］
病、感染性疾病等相关 。自噬参与牙周炎中病原 （tartrate⁃resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂
体防御、宿主免疫反应、炎症及牙槽骨代谢等过程， 盒（Sigma⁃Aldrich公司，美国），兔抗小鼠核因子⁃κB受
维持自噬稳态对控制牙周炎十分重要 。研究发 体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor⁃κВ
［9］
现，牙周炎患者较牙周健康者牙周膜及牙龈组织自 ligand，RANKL）抗体（Abcam 公司，美国），兔抗小鼠
噬水平增高 ［10-11］ 。大鼠腭侧牙龈区域局部注射自噬 Beclin⁃1 抗体、兔抗小鼠 p62 抗体（Proteintech 公司，
抑制剂 3⁃甲基腺嘌呤（3⁃methyladenine，3⁃MA）或氯 美国），即用型快捷免疫组化 MaxVision 检测试剂
TM
喹（chloroquine，CQ）可以减轻实验性牙周炎牙周组 盒、DAB显色试剂盒（福州迈新公司），Mayer’s苏木
［12］
织炎症及牙槽骨吸收 。 素染液（北京索莱宝公司）。
A20 在多种病理生理过程中参与自噬的调控， 1.2 方法
包括CD4 T细胞的存活、强直性脊柱炎、椎间盘变性 1.2.1 AAV注射
+
等 ［13-15］ 。我们前期研究发现，乏氧下A20基于TRAF6 参考既往研究中报道的小鼠牙龈局部 AAV 注
依 赖 性 自 噬 下 调 人 牙 周 膜 成 纤 维 细 胞（human 射方法 ［17］ 并加以更改。麻醉后，在小鼠上颌第二磨
［16］
periodontal ligament cell，hPDLC）促破骨分化活性 ， 牙腭侧牙龈近龈缘区域，使用量程为5 μL的汉密尔
然而自噬是否参与A20对小鼠实验性牙周炎的调控 顿注射器（33⁃G针头）注射2 μL病毒溶液（病毒颗粒
有待进一步研究。 5×10 个/μL）或者磷酸盐缓冲液（phosphate⁃buffered
9
本实验通过构建丝线结扎联合局部涂菌诱导 saline，PBS）。2周之后使用A20免疫荧光染色验证
的实验性牙周炎模型及小鼠牙龈注射A20过表达腺 AAV转染效率。
