Page 28 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第4期
               ·478 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年4月


              1.2.2  P. gingivalis培养                            近远中方向将连续切割组织为厚度 4 μm 的切片。
                  将 P. gingivalis 接 种 于 固 体 脑 心 浸 液（brain       石蜡切片经脱蜡至水后按照试剂盒说明书进行HE
              heart infusion，BHI）血琼脂培养基，置于37 ℃厌氧培               染色及TRAP染色。
              养箱内培养 5 d。挑选单克隆至液体培养基内厌氧                          1.2.7  免疫组织化学染色
              环境中孵育24 h备用。                                           石蜡切片经脱蜡至水后进行热抗原修复。通
              1.2.3  实验性牙周炎模型构建                                 过 3% H2O2抑制内源性过氧化物酶活性，使用山羊
                  为探索A20过表达对小鼠实验性牙周炎的治疗                         血清降低非特异性染色。组织与一抗（兔抗小鼠
              作用，随机将20只小鼠分为4组：无牙周炎（Control）                     RANKL、兔抗小鼠 Beclin⁃1 抗体、兔抗小鼠 LC3B
              组、牙周炎及PBS注射（PBS+P）组、牙周炎及阴性对                       抗体、兔抗小鼠 p62 抗体）反应 4 ℃过夜。PBS 冲
              照 AAV 注射（AAV+P）组、牙周炎及 AAV⁃A20 注射                  洗 3 次后，切片与快捷型酶标羊抗兔 IgG 聚合物
             （A20+P）组。PBS 或者 AAV 溶液注射 2 周后，丝线                   37 ℃共同孵育 15 min，DAB 显色液显色，Mayer’s 苏
              结扎结合局部涂菌构建小鼠实验性牙周炎模型。                             木素染液用于复染。应用Image⁃Pro Plus 6.0对免疫
              在第 14 天，用 5⁃0 无菌丝线紧密缠绕小鼠上颌第                       组化图片进行半定量分析。
              二磨牙颈部 1 圈并于颊侧打结，保持到第 24 天，                        1.3  统计学方法
              期间丝线如有脱落立即重新结扎。将 P. gingivalis                         采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行数据统计分
             （1×10 CFU/mL）重悬于包含 2%羧甲基纤维素钠                       析。所有定量数据表示为均值±标准差（x ± s）。多
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             （carboxymethylcellulose sodium，CMC）的 PBS 溶 液       组间数据比较使用方差分析，进一步两两比较采用
              中。在第15~17天，用无菌棉棒将100 μL P. gingivalis             Tukey检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
              菌悬液涂抹于小鼠上颌第二磨牙牙齿周围，连续涂抹
                                                                2 结     果
              3天。第24天处死小鼠，取上颌组织用于后续实验。
              1.2.4  微计算机断层扫描（microcomputed tomogra⁃            2.1  AAV⁃A20上调小鼠牙周组织A20表达
              phy，Micro⁃CT）                                          通过在小鼠上颌第二磨牙腭侧牙龈近龈缘区
                  组织用 4%多聚甲醛固定 24~48 h 后，自来水冲                   域注射 AAV⁃A20 与阴性对照 AAV 来探索 A20 过表
              洗过夜，并储存于70%酒精中。保鲜膜包裹组织置                           达对实验性牙周炎的影响。与注射PBS及阴性对照
              于软泡沫中以防止扫描过程中组织干燥或者移                              AAV 相比，注射 AAV⁃A20 有效上调小鼠上颌第一、
              位。Micro⁃CT（vivaCT80，SCANCO Medical 公司，瑞           第二磨牙之间牙周组织A20的表达（图1）。
              士）扫描样本，应用Skyscan软件进行3D重建及数据                       2.2  小鼠牙周组织内 A20 过表达减轻实验性牙周
              测量。根据先前文献报道方法               ［12］ 测量小鼠上颌第          炎所致牙周组织炎症及牙槽骨吸收
              二磨牙腭侧釉牙骨质界（cemento⁃enamel junction，                    小鼠上颌扫描 Micro⁃CT 后，3D 及 2D 重建图显
              CEJ）到牙槽嵴顶（alveolar bone crest，ABC）的距离。            示：与 Control 组相比，PBS+P 组及 AAV+P 组出现牙
              通过测量上颌第二磨牙腭侧5个不同区域CEJ⁃ABC                         槽骨吸收，CEJ⁃ABC 距离增加，表明实验性牙周炎
              的距离并计算均值用于统计分析。                                   模型的成功构建；与 PBS+P 组及 AAV+P 组相比，
              1.2.5  免疫荧光染色                                     A20+P 组腭侧牙槽骨吸收减轻，CEJ⁃ABC 距离减小
                  小鼠上颌组织用 4%多聚甲醛溶液固定后于                          （图2A、B）。小鼠上颌HE染色显示：与Control组相
              20%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，      比，PBS+P组及AAV+P组小鼠牙周组织出现大量炎

              EDTA）溶液中 4 ℃下脱钙 3~4 周。脱钙液每 2~3 d                  症细胞浸润、牙龈结合上皮向根方移位、牙周袋形
              更换1次。OCT包埋剂包埋组织并使用切片机沿第                           成及牙槽骨破坏；与 PBS+P 组及 AAV+P 组相比，
              二磨牙长轴近远中方向将组织加工成厚度 6 μm 的                         A20+P 组牙周组织炎症及牙槽骨破坏有明显缓解
              冰冻切片。抗原修复及封闭后，切片上滴加兔抗小                            （图2C）。
              鼠 A20 一抗 4 ℃下孵育过夜。PBS 冲洗后，滴加有                     2.3  小鼠牙周组织内 A20 过表达抑制破骨细胞生

              山羊抗兔二抗的切片于室温下避光孵育1 h。DAPI                         成及RANKL表达
              显色液被用于细胞核染色。                                           采用 TRAP 染色来标记小鼠上颌第一、第二磨
              1.2.6  形态学检测                                      牙之间的破骨细胞。与PBS+P组及AAV+P组相比，
                  石蜡包埋组织并使用切片机沿第二磨牙长轴                           A20+P组破骨细胞数目减少。Control组与A20+P组
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