Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第4期 李 禄，徐天华，舒环宇，等. 低强度脉冲超声对食源性肥胖小鼠脂肪细胞肥大的作用及机
2022年4月 制研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（4）：457-465 ·459 ·
集小鼠全血样本，超声路径下的皮肤、肌肉，分离小 表1 qPCR引物
鼠靶区的腹股沟脂肪垫并称重，液氮速冻后将其保 Table 1 Primers for qPCR
存于-80 ℃超低温冰箱，后续进行 Western blot 和 引物名称 引物序列（5′→3′）
qPCR 分析。部分标本采用 4%多聚甲醛固定，石蜡 PPARγ⁃F GTACTGTCGGTTTCAGAAGTGCC
PPARγ⁃R ATCTCCGCCAACAGCTTCTCCT
包埋后行HE染色。本研究已通过南京医科大学实
C/EBPα⁃F CGGGTCGCTGGATCTCT
验动物伦理委员会审查（IACUC⁃2008020）
C/EBPα⁃R GGCCTGACTCCCTCATCTT
1.2.2 超声方案
ADPN⁃F AGACCTGGCCACTTTCTCCTCATT
LIPUS 治疗设备包括超声波发生器（Agilent
ADPN⁃R AGAGGAACAGGAGAGCTTGCAACA
Technologies，美国）、宽频功率放大器（Verasonics 公 LEP⁃F GCAGTGCCTATCCAGAAAGTCC
司，美国）和超声平面换能器（重庆海扶医疗科技股 LEP⁃R GGAATGAAGTCCAAGCCAGTGAC
份有限公司）。参考前期体内外研究结果 ［9-11］ ，实 IRF4⁃F TCCGACAGTGGTTGATCGAC
验使用频率 0.5 MHz 的平面换能器，在声强达到 IRF4⁃R CCTCACGATTGTAGTCCTGCTT
77.20 mW/cm 时对靶区脂肪组织进行治疗。超声组 FOXO1⁃F GTACAGCGCATAGCACCA
2
FOXO1⁃R GCGACAGACAGAGTTCCC
小鼠在1.5%异氟烷麻醉下进行LIPUS超声辐照，每
ATGL⁃F GGAACCAAAGGACCTGATGACC
周3次（20 min/次）连续治疗10周。
ATGL⁃R ACATCAGGCAGCCACTCCAACA
1.2.3 组织石蜡切片HE染色
HSL⁃F GCTCATCTCCTATGACCTACGG
取小鼠超声路径下皮肤、肌肉及腹股沟脂肪 HSL⁃R TCCGTGGATGTGAACAACCAGG
垫，用4%多聚甲醛固定组织48 h，将标本脱水，石蜡 GAPDH⁃F AGGTCGGTGTGAACGGATTTG
包埋，切片厚度 5 μm。组织切片依照 HE 染色标准 GAPDH⁃R TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
方案进行，封片后镜下观察，采集图像。
1.2.4 甘油磷酸氧化酶⁃过氧化物酶（glycerol phosph⁃ 除沉淀，获得蛋白上清液。制备8%~12% SDS⁃PAGE
ate oxidase⁃p⁃aminophenazone，GPO⁃PAP）法测定组 胶，进行蛋白电泳分离总蛋白，将蛋白转移至PVDF
织内甘油三酯含量 膜，于 5%牛血清白蛋白溶液中常温孵育 2 h，后于
取小鼠新鲜分离的靶区腹股沟脂肪组织，使用 一抗溶液（1∶1 000 稀释）中 4℃孵育过夜，漂洗后
分析天平精确称重使其重量控制在100 mg左右，按 再与辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000 稀释）
重量（mg）∶体积（μL）=1∶9的比例加入9倍体积的匀 室温下孵育 2 h。漂洗后使用 ECL 试剂和化学成
浆介质无水乙醇，冰水浴条件下机械匀浆直至组织 像仪进行化学显影，使用 Image Lab 软件对图像
TM
彻底破碎。4℃ 2 500 r/min 离心 10 min，取上清，根 进行量化。
据甘油三酯检测试剂盒说明书进行检测计算。 1.3 统计学方法
1.2.5 脂肪组织RNA提取及qPCR 所有数据均来自3个独立实验，数据采用Excel
使用 TRIzol 试剂从 150 mg 腹股沟脂肪组织中 2019（16.0）录入，计量资料经检验，数据符合正态分
提取总RNA，0.5 μg总RNA逆转录合成第一链互补 布，方差齐，结果以均数±标准差（x ± s）表示，应用
cDNA。将合成的 cDNA 与 SYBR Green Master Mix、 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析和作图，
基因特异的引物混合，采用 ABI Prism 7900 系统进 多组间比较使用单因素方分析，事后检验使用
行qPCR扩增。每个样本进行3次重复分析，目标基 Bonferroni法。P < 0.05为差异具有统计学意义。
因由管家基因 GAPDH 归一化。所有 qPCR 引物见
2 结 果
表1。
1.2.6 脂肪组织蛋白提取及Western blot 2.1 LIPUS局部辐照无法减轻肥胖小鼠体重
称取 150 mg 脂肪组织于 500 μL RIPA 裂解液 在连续喂养10周后，高脂组小鼠体重大于普食
中，加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和 PMSF，冰 组小鼠体重，且差异有统计学意义（P < 0.001，表
水浴下机械匀浆直至组织破碎彻底，于-80 ℃低温 2），认为肥胖模型建立成功。超声组小鼠腹股沟脂
保存，第 2 天取出组织于冰上复温，12 000 g、4 ℃条 肪垫经过10周LIPUS辐照后，超声组与高脂组小鼠
件下离心 30 min 吸弃上层脂肪，重复 3 次直至上层 体重及体重增量均无显著性差异（表 2，图 1），提示
脂肪去除干净。最后一次 12 000 g 离心 15 min，去 LIPUS无法减轻食源性肥胖小鼠体重。
