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第42卷第7期       王 萍，王先丽，吴 迪，等. 生物降解Mg增强PLA复合膜用于引导骨再生的抗菌性能研究［J］.
                  2022年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：965-972                        ·967 ·


                1.2  方法                                           1.2.6  细胞增殖
                1.2.1  样品的制备                                          用MC3T3⁃E1和L929细胞系评价样品的生物相
                    为制备 Mg/PLA 复合膜，将数均分子量≈40，黏                    容性。细胞接种 24 h 后，用两种条件培养基代替
                度=2.66 dL/g 的 PLA 颗粒溶于二氯甲烷后，将溶液                   原培养基，以两种完全培养基作为对照，条件培养
                与 10%wt、20%wt 和 40%wt 的球形 Mg 颗粒（平均粒               1、3、5 d后测定细胞增殖。按CCK⁃8试剂盒要求，将
                径≈27 μm）充分混合。将该悬浮液在室温下倒入直                         细胞与 CCK⁃8 试剂共孵育 2 h，用酶标仪在 450 nm
                径为 150 mm 的玻璃器皿中，直至二氯甲烷完全挥                        波长下测定吸光度。
                发。最后，将0.3 mm厚的圆盘状复合膜在50 ℃下干                       1.2.7  抗菌性能评价
                燥 24 h。在接下来的实验中，将从 PLA 膜和 3 种复                        用革兰阳性的S.aureus（ATCC 25923）和革兰阴
                合膜上切割的不同形状样品用环氧乙烷灭菌，切割                            性的 E.coli（ATCC 25922）评价复合膜的抗菌性能。
                尺寸为 50 mm× 10 mm 的工字形试样进行拉伸试                      将E.coli和S.aureus的单菌落分别置于LB液体培养
                验。切取直径 15 mm 的圆盘样品，用于评价其抗菌                        基中，摇晃过夜（37 ℃，220 r/min），培养至对数生长
                性能。                                               期，用于后续实验。
                1.2.2  样品表面形貌观察                                       为了直观地观察细菌细胞膜形态的变化及材

                    用 扫 描 电 子 显 微 镜（scanning electron micro⁃      料表面细菌的生长情况，将 E.coli 和 S.aureus 悬液
                scope，SEM）对喷金后不同样品的表面形貌进行观                       （1×10 CFU/mL，1 mL/孔）接种于材料表面，37 ℃孵
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                察分析。                                              育 24 h。 PBS 洗涤 3 次，用 2.5%戊二醛 4 ℃固定过
                1.2.3  样品的力学性能                                    夜，采用乙醇（30%、50%、70%、90%、100%）对微生
                    为了研究不同试样的基本力学性能，采用电子                          物进行梯度脱水后 4 ℃保存，金溅射涂层后用扫描
                万能试验机在室温下以2 mm/min的速度和0.1 N的                      电镜观察。
                预负荷进行拉伸试验，同时记录应力⁃应变曲线。                                将 1 mL E.coli 和 S.aureus 悬液（1×10 CFU/mL）
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                强度和应变值是3次测量的平均值。复合膜抗拉强                            接种于复合膜表面，37 ℃孵育 24 h。用 PBS 轻轻冲
                度的计算公式：δ=Fmax/A；Fmax为最大荷载值（N），A为                  洗复合膜表面 3 次，然后在 1 mL PBS 中超声分离黏
                试验试件的横截面积（mm）。计算拉伸应变的公式：                          附在膜表面的细菌（50 Hz，5 min）。将得到的菌液
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                ε（%）=ΔL 0/L0×100%；L0 为试件的标尺长度（mm），                分别稀释 1×10 、1×10 倍，将稀释后的菌液 100 μL
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                ΔL0为L0的增量（mm）。                                    均匀涂抹于LB固体培养基平板上，24 h后计数。抑
                1.2.4  浸没实验                                       菌率计算如下：抑菌率（%）=（对照组 CFU -实验组
                    将 样 品 在 磷 酸 盐 缓 冲 液（phosphate buffered        CFU）/对照组CFU × 100%。
                saline，PBS）中以1∶10的表面积/体积比浸泡24 h，用                 1.3  统计学方法
                pH计记录每个时间点的pH值。                                       实验共进行 3 个重复，数据以均数±标准差
                1.2.5  细胞培养与培养基制备                                （x ± s）表示。对于两组以上的比较，使用 Tukey’s
                    小鼠上皮样成纤维细胞（L929）和小鼠胚胎成                        或Dunnett’s事后检验的单因素方差分析（ANOVA）。
                骨前体细胞（MC3T3⁃E1）在含有下述培养基的细胞                        P < 0.05为差异有统计学意义。
                培养皿中培养。细胞在 37 ℃、95%相对湿度，5%
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                CO2浓度的培养箱中培养。
                    为了研究 Mg/PLA 复合膜的生物相容性，制备                      2.1  Mg/PLA复合膜的表征
                了以下培养基。完全培养基：α⁃MEM和DMEM分别                             本研究制备了负载不同含量Mg颗粒的Mg/PLA

                添加 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%             复合膜。SEM 观察显示复合膜的表面形貌与 PLA
                青霉素（100 U/mL）和硫酸链霉素（100 mg/mL）制                   膜相似，相对较为平坦，但复合膜表面粗糙度较大
                备α⁃MEM 完全培养基和 DMEM 完全培养基。条件                      （图 1）。在 10 000 倍的放大倍数下，复合膜粗糙表
                培养基：按照 ISO⁃10993 标准，用两种完全培养基、                     面更明显（图 1）。与 PLA 膜相比，复合膜的表面粗
                浸提标准为 1.25 cm /mL，获取样品 24 h 的浸提液。                 糙度增加，应该与球形Mg颗粒的加入有关。
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                其中，α⁃MEM 完全培养基用于 MC3T3⁃E1 细胞的培                        膜的拉伸应力-应变曲线如图2所示。随着复合
                养，DMEM完全培养基用于L929细胞的培养。                           膜中Mg含量的增加，复合膜机械强度呈现出先增加
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