Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 8

第43卷第1期
               · 2  ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年1月


                  多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种                涡旋振荡器上轻轻摇匀，置于37 ℃培养箱分别培养
              浆细胞恶性肿瘤，在其发生和发展过程中，骨髓瘤                            1、2、3 d后，取出96孔板，在每孔中加入10 μL CCK⁃8
              细胞与骨髓微环境的相互作用起到非常重要的作                             试剂，避光孵育约1 h，酶标仪测量在450 nm波长处
              用 ［1-2］ 。成骨细胞作为为骨髓微环境中的重要细胞                       的吸光值并记录。
                                                ［3］
              成分之一，在MM中可出现明显的异常 。MM患者                           1.2.3  Western blot检测蛋白的表达
              成骨细胞的成骨活性下降，而破骨细胞活性亢进是                                 收集细胞，于冰上裂解，提取总蛋白，用BCA法
              骨髓瘤患者骨骼病变的核心机制               ［4-6］ 。此外，如何纠        测定蛋白浓度。配制分离胶以及浓缩胶，按每个加
              正 MM 患者的成骨细胞功能障碍，也是 MM 领域的                        样孔约 30 μg 蛋白量上样。电泳后转膜到孔径为
              研究热点。多西环素（doxycycline，DOX）是一种临                    0.45 μm的PVDF膜上，封闭后将膜放入相应的一抗
              床上常用于抗菌治疗的抗生素。本课题组先前发                             中，在4 ℃环境中摇床孵育过夜。洗膜、摇床上孵育
              现DOX在体外有抗骨髓瘤细胞增殖的作用                    ［7-8］ 。鉴   二抗，孵育结束洗膜、曝光。用 Image J 软件进行灰
              于骨髓微环境中的成骨细胞在 MM 中的重要作用，                          度值分析。

              本研究拟探索DOX在体外对成骨细胞株MC3T3⁃E1                        1.2.4  茜素红染色检测成骨
              成骨分化的影响及相应机制。                                          当培养的 MC3T3⁃E1 细胞融合度达到 80%时，
                                                                消化并调整细胞浓度 1×10 个/mL 接种至 12 孔板中
                                                                                        4
              1 材料和方法
                                                                的无菌爬片上，每孔培养体系为 1 mL。培养过夜
              1.1  材料                                           后，不同组别更换培养基，每孔加入 1 mL 相应培养
                  小鼠前成骨细胞系（MC3T3⁃E1 细胞，中科院上                     基。设置阴性对照组（含完全培养基）、诱导组（成
              海细胞库）；α⁃MEM 培养基、胎牛血清（FBS）（Gibco                   骨诱导液）、实验组（含DOX的成骨诱导液）。每3 d
              公司，美国）；多西环素（Sigma 公司，美国）；MEK 抑                    更换新鲜的各组培养基。诱导14、21 d时，经4%多
              制剂U0126（MCE 公司，美国）；CCK⁃8试剂盒（同仁                    聚甲醛固定30 min，茜素红染色检测成骨，日常光线
              公司，日本）；PCR 引物（上海生工生物公司）；逆转                        下标本拍照、倒置显微镜下镜检。
              录试剂盒、SYBR Green 试剂盒（Takara 公司，日本）；                1.2.5  实时定量PCR（qPCR）检测基因表达
              引物委托上海生工生物技术有限公司设计并合                                   收集细胞，冰上裂解，用 TRIzol 提取细胞总
              成。引物序列如下：OCN⁃F 5′⁃TGACGAGTTGGCT⁃                  RNA，酶标仪上测定浓度。按照试剂盒说明配制逆
              GACCA⁃3′，OCN⁃R 5′⁃AGGGTGCCTGGAGAGGAG⁃             转录体系，在PCR扩增仪中进行逆转录；转录完后，
              3′ ；Runx2 ⁃ F 5′ ⁃ TTGACCTTTGTCCCAATGC ⁃ 3′ ，     将合成的 cDNA 放在冰上冷却。按 SYBR Green 试
              Runx2⁃R 5′⁃AGGTTGGAGGCACACATAGG⁃3′；β⁃ac⁃          剂盒说明书在冰上配制 20 μL 反应体系，加入 8 连
              tin⁃F 5′⁃CCTGGCACCCAGACAAAT⁃3′，β⁃actin⁃R 5′⁃      管中，在仪器中反应，最后进行数据处理分析。
              GGGCCGGACTCGTCATAC⁃3′。兔抗人p⁃ERK1/2抗                1.3  统计学方法
              体、兔抗人p⁃MEK抗体、兔抗人GAPDH抗体等（CST                           数据处理、统计分析用GraphPad Prism 5.0软件
              公司，美国）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、蛋白上样                         进行操作；用Image J软件计算蛋白及茜素红染色灰
              缓冲液（5×）、预染 Marker（杭州碧云天生物技术有                      度值。实验数据用均数±标准差（x ± s）表示，数据资
              限公司）。                                             料符合正态分布（S⁃W 检验），用单因素方差分析方
              1.2  方法                                           法对各实验组组间进行两两比较（Dunnett⁃t 检验）。
              1.2.1  细胞培养和药物处理                                  P < 0.05为差异有统计学意义。
                  MC3T3⁃E1细胞用含有10％ FBS的α⁃MEM培养
                                                                2 结     果
              液培养，取生长状态良好的细胞进行实验。用于实
              验的 DOX 浓度为 5、10、20、40 mg/L，U0126 浓度为              2.1  不同浓度 DOX 对前成骨细胞 MC3T3⁃E1 细胞
              5、10 μmol/L。                                      增殖的影响
              1.2.2  CCK⁃8检测细胞增殖                                     取生长状态良好的 MC3T3⁃E1 细胞，按实验分

                  在96孔板中每孔接种50 μL的细胞悬液（1×10                 5   组处理 1、2、3 d，发现与对照组相比，5~40 mg/L 的
              个/mL），将 DOX 用培养液配制成所需的浓度，实验                       DOX 对 MC3T3⁃E1 细胞增殖没有明显的抑制作用
              组孔加入50 μL药物；对照组加入50 μL培养液。在                       （图1）。
   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13