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第43卷第1期 耿佳伟，费小明，汤 郁，等. 多西环素通过MEK/ERK信号通路促进MC3T3⁃E1细胞株体外
2023年1月 成骨分化［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（01）：001-007，106 · 3 ·

A B
1.5 30
● 1 d ● 1 d
■ 2 d ■ 2 d
▲
▲ ▲ ▲ ▲ 3 d 20 ▲ 3 d
nm ） 1.0 ■ ■ ■ ■ ▲ （ % ） ■ ▲
■
■
（ 450 D 0.5 抑制率 10 ■ ■ ▲ ●
▲
▲
● ● ● ● ● 0 ● ● ●
0 -10
0 5 10 20 40 5 10 20 40
DOX（mg/L） DOX（mg/L）

A：生长曲线；B：抑制率曲线；DOX 0 mg/L为对照组（n=3）。
图1 CCK⁃8法检测DOX对前成骨细胞MC3T3⁃E1增殖的影响
Figure 1 Effect of DOX on the proliferation of preosteoblastic MC3T3⁃E1 by CCK⁃8 assay

2.2 茜素红染色检测 DOX 对 MC3T3⁃E1 细胞成骨 Western blot 实验 DOX 浓度均选用 10 mg/L。随后
分化的影响 Western blot 法检测 p⁃MEK、p⁃ERK 蛋白水平后发
既往Wisniewska等 发现DOX本身可以直接抑 现，与对照组比较，10 mg/L DOX处理2 d后p⁃MEK、
［9］
制 ALP 的活性，对 ALP 染色有干扰，我们前期实验 p⁃ERK 蛋白表达上调，且差异具有统计学意义
结果与其报道一致，故本研究不采用ALP染色作为 （P < 0.05，图4B、C）。
成骨分化标志。MC3T3′⁃E1 细胞株体外成骨诱导 2.5 MEK 抑制剂 U0126 处理 MC3T3⁃E1 细胞，检测
过程中，在第 14、21 天进行茜素红染色，检测成骨 N⁃cadherin蛋白及相关通路蛋白的表达情况
分化的效果。在第 14 天时，肉眼及显微镜下观察 为了进一步探究 DOX 是否对 MEK/ ERK 通路
茜素红染色 3 组间没有明显区别（图 2A、B）。成骨 产生影响。用浓度为5、10 μmol/L的MEK的抑制剂
诱导21 d时，诱导组与实验组均可见明显红染。与 U0126处理MC3T3⁃E1细胞2 d后，Western blot 检测
诱导组比较，加入 DOX 的实验组染色更强、钙结节 N⁃cadherin、p⁃ERK、p⁃MEK表达量。与对照组比较，
更多（P < 0.05，图2C~E）。这一结果提示，在体外成 不同浓度 U0126 处理 2 d 后 N⁃cadherin 蛋白表达上
骨诱导分化中，DOX 可促进 MC3T3⁃E1 细胞的成骨 调（P < 0.05，图5A）；与此同时，p⁃MEK、p⁃ERK 蛋白
分化功能。 表达下降，但 5 μmol/L 的 U0126 对 p⁃ERK 的抑制作
2.3 qPCR 检测 DOX 对 MC3T3⁃E1 细胞相关成骨基 用更明显（P < 0.05，图5B、C），故后续实验U0126选
因的影响 用5 μmol/L。
MC3T3⁃E1 细胞经成骨诱导 21 d 后，提取总 2.6 U0126 联合 DOX 处理 MC3T3⁃E1 细胞，检测相
RNA 后利用 qPCR 检测相关成骨基因 OCN、Runx2 关目的蛋白的表达情况
的相对表达量。与阴性对照组对比，诱导组及 用 5 μmol/L U0126 联 合 10 mg/L DOX 处 理
10 mg/L DOX实验组，相关成骨基因均上调，说明成 MC3T3⁃E1细胞2 d，Western blot 法检测N⁃cadherin、
骨诱导成功，但诱导组与实验组间比较，无统计学 p⁃MEK 和 p⁃ERK 蛋白的表达。与 DOX 单独处理组
差异（图3），这提示在成骨诱导的21 d，有DOX与无 比较，联合处理组 N⁃cadherin 水平较 DOX 单独处理
DOX组的OCN和Runx2的mRNA水平无差异。 组升高，且联合处理组p⁃MEK及p⁃ERK蛋白表达较
2.4 DOX处理MC3T3⁃E1细胞后，N⁃cadherin、p⁃MEK、 单独处理组降低（图6）。
p⁃ERK蛋白的表达情况 2.7 U0126 联合 DOX 处理 MC3T3⁃E1 细胞，茜素红
用 5、10 mg/L 的 DOX 分别处理 MC3T3⁃E1 细胞 检测MC3T3⁃E1细胞成骨分化的变化
2 d，Western blot 法检测 N⁃cadherin 蛋白的表达情 随后的实验探索使用 U0126 抑制 MEK/ERK 通
况。结果发现，与对照组比较，不同浓度 DOX 处理 路对DOX促进MC3T3⁃E1细胞成骨分化的作用有何
MC3T3⁃E1细胞2 d后，其N⁃cadherin蛋白表达下降， 影响。实验共分为5组：①阴性对照组，②阳性成骨

且差异有统计学意义（P < 0.05，图 4A）。结合 DOX 对照组，③DOX 处理组，④U0126处理组，⑤DOX 联
对细胞增殖和蛋白表达的影响，后续的成骨及 合 U0126 处理组。成骨诱导 21 d 后，阳性成骨组出