Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第12期
               ·1624 ·                         南   京 医 科       大 学      学 报                        2023年12月


                  帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见             PI）（北京索莱宝科技有限公司），TLR2抗体（Abcam
              的与年龄相关的神经系统退行性疾病，影响2%~3%                          公司，英国），p⁃NF⁃κB 抗体、NF⁃κB 抗体（CST 公司，
              的65岁以上人群 。除典型的运动缺陷外，患者往                           美国），Bcl⁃2（SAB 公司，美国），Bax、caspase⁃3（CST
                             ［1］
              往表现出一些非运动症状，如嗅觉减退、自主神经                            公司，美国），LC3、P62、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠
              功能紊乱、睡眠障碍、感觉障碍等，这些症状在诊断                           IgG 抗体（Proteintech，美国），荧光显微镜（Olympus
              为帕金森病前可持续数年，然而对其具体发病机制                            公司，日本），酶标仪（FLx800 ，Bio⁃Tek 公司，美
                                                                                            TM
              仍然缺乏有效认识        ［2-3］ 。                           国），Tanon5200 全自动化学发光成像分析系统（上
                  PD 病理表现为黑质多巴胺能神经元丢失和路                         海天能科技有限公司）。

              易小体的形成，其中磷酸化α⁃突触核蛋白（phosphory⁃                    1.2  方法
              lated⁃α⁃synuclein，p⁃α⁃syn）是构成路易小体主要成              1.2.1 RSC96细胞培养与分组
                ［4］
              分 。凋亡与自噬作为维持细胞活性和生物体稳态                                 RSC96细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公
              的重要过程，与神经系统退行性疾病密切相关。                             司，使用含有 10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的
              以往研究发现，自噬失调可导致α⁃突触核蛋白                             Dulbecco 改良 Eagle 培养基，置于 5%CO2、37 ℃培养
             （α⁃synuclein，α⁃syn）的异常聚集，促进溶酶体释放                   箱中进行培养，每 2~3 d 进行换液。细胞随机分为
              促凋亡蛋白从而加速神经元凋亡               ［5-6］ 。              PBS 组（与 MPP 等体积 PBS 处理 24 h）、MPP 组
                                                                               +
                                                                                                           +
                  Toll 样 受 体（toll ⁃ like receptor，TLR），尤 其 是    （0.5 mmol/L MPP 处理 24 h）和 MPP +CU⁃CPT22 组
                                                                                                 +
                                                                                +
                                                                                                       ［8］
              TLR2和TLR4，在PD患者中失调，且参与早期α⁃syn                     （8 μmol/L CU⁃CPT22，使用DMSO进行溶解） 。
                    ［7］
              的聚集 。前期我们对 1⁃甲基⁃4⁃苯基⁃1，2，3，6⁃四                    1.2.2 CCK⁃8检测细胞存活率
                                                                                                         4
              氢吡啶盐酸盐（1⁃methyl⁃4⁃phenyl⁃1，2，3，6⁃tetrahy⁃              使用 CCK⁃8 检测细胞存活率，按照 1×10 个/孔
              dropyridine，MPTP）慢性PD小鼠坐骨神经进行测序，                  的密度将RSC96细胞接种于96孔板后，取对数生长
              结果显示，相较于生理盐水组，TLR2在MPTP组显著                        期的细胞使用MPP（0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L）
                                                                                 +
                  ［8］
              上调 。越来越多的证据表明，TLR2在调节神经元                          进行处理，24 h后弃去旧培养基，加入按照9∶1比例
              自噬以及α⁃syn的清除中发挥重要作用              ［9-10］ 。此外，激     配备的 CCK⁃8 溶液，培养箱中孵育 1 h 后使用酶标
              活TLR2损害自噬溶酶体途径 。课题组既往研究发                          仪在 450 nm 处检测吸光度值，细胞存活率=［（MPP                 +
                                       ［11］
              现，PD患者腓肠神经、MPTP小鼠坐骨神经、过表达人                        组吸光度-空白孔吸光度）/（PBS 组吸光度-空白孔
              源性A53T α⁃syn的大鼠迷走神经髓鞘均存在一定程                       吸光度）］×100%    ［15］ 。
              度的破坏，如髓磷脂中出现大量的脂质空泡，鞘破裂                           1.2.3 TUNEL检测细胞凋亡水平
              以及雪旺细胞（Schwann cell，SC）肿胀，同时观察到SC                      在24孔板中接种细胞爬片，待其贴壁并生长状
              中p⁃α⁃syn 的沉积，这提示 SC 损害在 PD 外周神经                   态良好时分组处理24 h，取出后PBS冲洗2次，每次
              病变如感觉障碍和自主神经功能障碍中发挥一定                             5 min，室温下使用4%多聚甲醛固定60 min，后续操
              作用  ［8，12-13］ 。此外，前期研究已证实使用MPTP作为研                作按照制造商的说明进行。使用含DAPI 的防荧光
              究 PD 自主神经功能障碍模型的适用性                 ［14］ 。然而，     淬灭剂封片后在荧光显微镜下观察，TUNEL染色阳
              TLR2是否参与SC凋亡与自噬过程有待进一步研究。                         性细胞核呈现黄绿色，每张爬片取 3 个不同视野记
                  因此，本研究在体外细胞水平观察 PD 中 SC 是                     录阳性细胞数均值，并统计4张爬片阳性细胞占比，
                                                                                                ［16］
              否存在凋亡与自噬功能障碍，并进一步探讨MPP 诱                          使用GraphPad Prism 9进行统计分析 。
                                                         +
              导的 SC 自噬与凋亡功能障碍的机制，以期为 PD 自                       1.2.4 细胞总蛋白提取和Western blot
              主神经功能障碍的发生提供新的见解。                                      细胞经处理 24 h 后从培养箱中取出，使用 PBS
                                                                缓冲液清洗 3 次，每次 5 min，加入含有蛋白酶抑制
              1  材料和方法
                                                                剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，刮下细胞后冰上
              1.1  材料                                           裂解30 min，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min，
                  MPP（Sigma 公司，美国），CU⁃CPT22（MCE 公               吸取上清，使用 BCA 试剂盒进行蛋白定量，上样量
                      +
              司，美国），TUNEL原位细胞凋亡检测试剂、FITC（上                      均为30 μg，SDS⁃PAGE 80 V恒压电泳，300 mA 恒流
              海生工生物工程股份有限公司），CCK⁃8 试剂盒                          转 PVDF 膜后，TBST 配制 5%脱脂奶粉溶液，封闭
             （APExBIO 公司，美国），抗荧光淬灭封片剂（含 DA⁃                     2 h，TBST 清洗 3 次，每次 10 min。一抗稀释比 P62
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