Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第12期
·1624 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年12月
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见 PI)(北京索莱宝科技有限公司),TLR2抗体(Abcam
的与年龄相关的神经系统退行性疾病,影响2%~3% 公司,英国),p⁃NF⁃κB 抗体、NF⁃κB 抗体(CST 公司,
的65岁以上人群 。除典型的运动缺陷外,患者往 美国),Bcl⁃2(SAB 公司,美国),Bax、caspase⁃3(CST
[1]
往表现出一些非运动症状,如嗅觉减退、自主神经 公司,美国),LC3、P62、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠
功能紊乱、睡眠障碍、感觉障碍等,这些症状在诊断 IgG 抗体(Proteintech,美国),荧光显微镜(Olympus
为帕金森病前可持续数年,然而对其具体发病机制 公司,日本),酶标仪(FLx800 ,Bio⁃Tek 公司,美
TM
仍然缺乏有效认识 [2-3] 。 国),Tanon5200 全自动化学发光成像分析系统(上
PD 病理表现为黑质多巴胺能神经元丢失和路 海天能科技有限公司)。
易小体的形成,其中磷酸化α⁃突触核蛋白(phosphory⁃ 1.2 方法
lated⁃α⁃synuclein,p⁃α⁃syn)是构成路易小体主要成 1.2.1 RSC96细胞培养与分组
[4]
分 。凋亡与自噬作为维持细胞活性和生物体稳态 RSC96细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公
的重要过程,与神经系统退行性疾病密切相关。 司,使用含有 10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的
以往研究发现,自噬失调可导致α⁃突触核蛋白 Dulbecco 改良 Eagle 培养基,置于 5%CO2、37 ℃培养
(α⁃synuclein,α⁃syn)的异常聚集,促进溶酶体释放 箱中进行培养,每 2~3 d 进行换液。细胞随机分为
促凋亡蛋白从而加速神经元凋亡 [5-6] 。 PBS 组(与 MPP 等体积 PBS 处理 24 h)、MPP 组
+
+
Toll 样 受 体(toll ⁃ like receptor,TLR),尤 其 是 (0.5 mmol/L MPP 处理 24 h)和 MPP +CU⁃CPT22 组
+
+
[8]
TLR2和TLR4,在PD患者中失调,且参与早期α⁃syn (8 μmol/L CU⁃CPT22,使用DMSO进行溶解) 。
[7]
的聚集 。前期我们对 1⁃甲基⁃4⁃苯基⁃1,2,3,6⁃四 1.2.2 CCK⁃8检测细胞存活率
4
氢吡啶盐酸盐(1⁃methyl⁃4⁃phenyl⁃1,2,3,6⁃tetrahy⁃ 使用 CCK⁃8 检测细胞存活率,按照 1×10 个/孔
dropyridine,MPTP)慢性PD小鼠坐骨神经进行测序, 的密度将RSC96细胞接种于96孔板后,取对数生长
结果显示,相较于生理盐水组,TLR2在MPTP组显著 期的细胞使用MPP(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L)
+
[8]
上调 。越来越多的证据表明,TLR2在调节神经元 进行处理,24 h后弃去旧培养基,加入按照9∶1比例
自噬以及α⁃syn的清除中发挥重要作用 [9-10] 。此外,激 配备的 CCK⁃8 溶液,培养箱中孵育 1 h 后使用酶标
活TLR2损害自噬溶酶体途径 。课题组既往研究发 仪在 450 nm 处检测吸光度值,细胞存活率=[(MPP +
[11]
现,PD患者腓肠神经、MPTP小鼠坐骨神经、过表达人 组吸光度-空白孔吸光度)/(PBS 组吸光度-空白孔
源性A53T α⁃syn的大鼠迷走神经髓鞘均存在一定程 吸光度)]×100% [15] 。
度的破坏,如髓磷脂中出现大量的脂质空泡,鞘破裂 1.2.3 TUNEL检测细胞凋亡水平
以及雪旺细胞(Schwann cell,SC)肿胀,同时观察到SC 在24孔板中接种细胞爬片,待其贴壁并生长状
中p⁃α⁃syn 的沉积,这提示 SC 损害在 PD 外周神经 态良好时分组处理24 h,取出后PBS冲洗2次,每次
病变如感觉障碍和自主神经功能障碍中发挥一定 5 min,室温下使用4%多聚甲醛固定60 min,后续操
作用 [8,12-13] 。此外,前期研究已证实使用MPTP作为研 作按照制造商的说明进行。使用含DAPI 的防荧光
究 PD 自主神经功能障碍模型的适用性 [14] 。然而, 淬灭剂封片后在荧光显微镜下观察,TUNEL染色阳
TLR2是否参与SC凋亡与自噬过程有待进一步研究。 性细胞核呈现黄绿色,每张爬片取 3 个不同视野记
因此,本研究在体外细胞水平观察 PD 中 SC 是 录阳性细胞数均值,并统计4张爬片阳性细胞占比,
[16]
否存在凋亡与自噬功能障碍,并进一步探讨MPP 诱 使用GraphPad Prism 9进行统计分析 。
+
导的 SC 自噬与凋亡功能障碍的机制,以期为 PD 自 1.2.4 细胞总蛋白提取和Western blot
主神经功能障碍的发生提供新的见解。 细胞经处理 24 h 后从培养箱中取出,使用 PBS
缓冲液清洗 3 次,每次 5 min,加入含有蛋白酶抑制
1 材料和方法
剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,刮下细胞后冰上
1.1 材料 裂解30 min,在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min,
MPP(Sigma 公司,美国),CU⁃CPT22(MCE 公 吸取上清,使用 BCA 试剂盒进行蛋白定量,上样量
+
司,美国),TUNEL原位细胞凋亡检测试剂、FITC(上 均为30 μg,SDS⁃PAGE 80 V恒压电泳,300 mA 恒流
海生工生物工程股份有限公司),CCK⁃8 试剂盒 转 PVDF 膜后,TBST 配制 5%脱脂奶粉溶液,封闭
(APExBIO 公司,美国),抗荧光淬灭封片剂(含 DA⁃ 2 h,TBST 清洗 3 次,每次 10 min。一抗稀释比 P62