Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第12期 李杨夏，佟 晴，程 越，等. TLR2/NF⁃κB通路介导MPP 诱导的RSC96细胞凋亡与自噬［J］.
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2023年12月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（12）：1623-1629 ·1625 ·

为1∶800，β⁃actin 为1∶5 000，其余均为1∶1 000，4 ℃ 用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
孵育过夜，TBST 洗膜 3 次。二抗稀释比山羊抗体
2 结 果
1∶5 000、山羊抗鼠 1∶5 000，室温孵育 1.5 h，再次洗
膜后滴加ECL发光液在化学发光成像系统中显影， 2.1 MPP 抑制RSC96细胞活力，同时诱导细胞凋亡
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Image J统计条带灰度值分析蛋白水平。 CCK⁃8结果显示，相较于PBS组，RSC96细胞经
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1.2.5 实时定量PCR 不同浓度MPP（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L）处理后
收集各组RSC96细胞并提取总RNA，使用逆转 增殖能力下降，且呈现浓度依赖性（图 1A），选择不
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录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA，实时定量 PCR 引起细胞大量死亡的MPP 刺激浓度（0.5 mmol/L）进
（real ⁃ time quantitative PCR，RT ⁃ qPCR）用 于 检 测 行后续实验。TUNEL 染色结果显示，与 PBS 组相
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TLR2 基因的表达水平。引物序列 TLR2（F：5′⁃TC⁃ 比，MPP 组阳性细胞数目增加（图1B、C），提示MPP +
CATGTCCTGGTTGACTGG⁃3′，R：5′⁃AGGAGAAGG⁃ 诱导RSC96细胞出现凋亡。Western blot 结果显示，
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GCACAGCAGAC⁃3′），GAPDH（F：5′⁃TGAAGGTCG⁃ 与 PBS 组相比，MPP 组细胞 cleaved caspase⁃3/cas⁃
GTGTCAACGGATTTGGC ⁃ 3′ ，R：5′ ⁃ CATGTAGGC⁃ pase⁃3水平升高（图1D、E），同时Bcl⁃2/Bax水平降低
CATGAGGTCCACCAC⁃3′）。 （图1D、F）。综上，MPP 诱导RSC96细胞凋亡，显著
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1.3 统计学方法 降低增殖能力。
使用 GraphPad Prism 9 软件进行统计学分析。 2.2 MPP 降低RSC96细胞自噬水平
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数据使用均数±标准误（x ± sx ）表示，两组间比较采 为了探究MPP 对RSC96细胞自噬水平的影响，
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A 150 ***
nm ） 100 **

（ 450 D 50

0
PBS 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9
MPP（mmol/L）
B DAPI TUNEL Merge（×10） Large（×40） C
（ % ） 10 **
TUNEL阳性细胞率 4 2
PBS 8 6

0
PBS MPP +

MPP +

D PBS MPP + E * F
caspase⁃3 35 kDa **
cleaved caspase⁃3/ 16 kDa 1.0 1.0
β⁃actin 42 kDa cleaved caspase⁃3/ caspase⁃3 蛋白相对表达量 1.5 Bcl⁃2/Bax 蛋白相对表达量 1.5
Bcl⁃2 26 kDa 0.5 0.5
Bax 20 kDa
β⁃actin 42 kDa 0 0
PBS MPP + PBS MPP +
A：CCK⁃8 检测不同浓度 MPP 刺激后 RSC96 细胞增殖水平（n=9）；B：各组 TUNEL 染色结果；C：各组 TUNEL 阳性细胞百分比的定量分析
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（n=4）；D：各组cleaved caspase⁃3/ caspase⁃3和Bcl⁃2/Bax蛋白表达水平代表性图像；E：各组cleaved caspase⁃3/caspase⁃3蛋白表达水平的定量比
较（n=3）；F：各组Bcl⁃2/Bax蛋白表达水平的定量比较（n=3）。两组比较，P<0.05，P<0.01， P<0.001。
**
***
*
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图1 MPP 诱导RSC96细胞活力下降与凋亡
Figure 1 MPP induces decreased viability and apoptosis in RSC96 cells
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