Page 82 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第3期
               ·372 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年3月


              provide novel insights into the diagnosis and treatment of aforementioned diseases.
             ［Key words］ untargeted metabolomics；systemic lupus erythematosus；rheumatoid arthritis
                                                                            ［J Nanjing Med Univ，2023，43（03）：371⁃379］





                  随着“后基因组时代”到来，代谢组学研究技术                         脉血 3 mL，以 4 ℃ 1 000 g 离心 10 min 去除血细胞，
              应运而生，它通过研究生物体液内低分子量代谢物                            获得血清样本分装后置于-80 ℃保存。进行色谱⁃
              的表达谱，揭示整个代谢系统受内、外因素影响的                            质谱分析前，先对血清样本进行预处理，步骤如
                  ［1］
              变化 。由于比基因组学和蛋白质组学更能反映细                            下：取-80 ℃保存的血清样本在 4 ℃下缓慢解冻，
              胞或生物体的表型，代谢组学更适用于研究疾病诊                            从每个样本中取100 μL加入400 μL预冷的甲醇/乙
              断、分类、预后以及挖掘潜在标志物               ［2-3］ 。            腈（1∶1，V/V），涡旋混匀，-20 ℃静置 60 min 去除蛋
                  系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，         白质，将混合物离心20 min（14 000 g，4 ℃），取上清液
              SLE）是一种慢性自身免疫病，可引起多器官系统损                          真空干燥。进行亲水相互作用超高效液相色谱⁃四级
              伤，因其临床表现多样且某些症状、体征可与其他                            杆飞行时间质谱联用技术（hydrophilic interaction
              风湿免疫病相“重叠”，常给临床医生带来诊断上的                           and ultra ⁃ high performance liquid chromatography
                  ［4］
              困扰 ，较易与一种慢性炎症性免疫病类风湿关节                            coupled with quadrupole⁃time⁃of⁃flight mass spectrom⁃
              炎（rheumatoid arthritis，RA）混淆。RA 除了典型的             etry，HILIC UHPLC⁃Q⁃TOF MS）分析时，在干燥后的
              类风湿结节和关节损伤外，也可有肺部受累、血管                            上清中加入 100 μL 乙腈/水（1∶1，V/V）溶剂使其
              炎及全身并发症等关节外表现 。                                   重 新 溶 解 ，涡 旋 混 匀 后 离 心 15 min（14 000 g，
                                         ［5］
                  目前关注 SLE 和 RA 代谢特征差异的研究较                      4 ℃），取上清液进样分析。为了在进样前确定仪
              少，本研究采用非靶向代谢组学方法，探索 SLE 和                         器状态并平衡色谱⁃质谱系统，同时监测整个实验
              RA 的血清代谢谱特征，筛选疾病相关的潜在代谢                           过程中系统的稳定性，将每个样品等比例混合以
              标志物，为寻找上游关键表达调控基因，探索差异                            制备质控样本。
              代谢物或代谢途径与疾病之间的相关性奠定基础。                                 HILIC UHPLC⁃Q⁃TOF MS 分析：所有血清样本
                                                                均使用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统
              1  对象和方法
                                                                （UHPLC）（Agilent Technologies 公司，美国）HILIC 色
              1.1  对象                                           谱柱进行分离，在色谱柱（Waters，ACQUITY UPLC
                  招募 2020 年 1—6 月在南京鼓楼医院风湿免疫                    BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100.0 mm）上对主要极
              科住院的SLE 及RA 患者各30例，分别符合美国风                        性代谢物进行分离后，通过Triple TOF 5600+质谱仪
              湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）        （AB SCIEX公司，美国）进行质谱分析。
                                       ［6］
              1997年修订的SLE诊断标准 及1987年制定的 RA                      1.2.2 代谢组学数据分析
                      ［7］
              分类标准 。排除标准：患有药物性狼疮或合并其                                 将HILIC UHPLC⁃Q⁃TOF MS生成的原始数据经
              他自身免疫病、心血管疾病、糖尿病、终末期肾病、                           Proteo Wizard 转换为.mzXML 格式文件，采用 XCMS
              活动性恶性肿瘤、活动性全身感染的患者，酗酒、吸                           程序进行峰对齐、保留时间校正和峰面积提取。检索
              烟或有口服避孕药史的患者，妊娠期或哺乳期女性                            和比对实验室自建数据库（上海中科新生命生物科技
              患者。同时招募了 30 例健康女性志愿者作为健康                          有限公司），采用精确质量数匹配（Δm/z <25 ppm）和
              对照（healthy control，HC）组，入组标准：无慢性基                 二级谱图匹配的方式进行代谢物结构鉴定。首先
              础疾病，志愿者本人及其一级亲属均无自身免疫                             过滤峰强度数据，从 XCMS 提取的数据中删除组别
              病病史，近期未服用任何药物。本研究所有实验                             总和>2/3 的离子峰。应用 SIMCA⁃P 14.1 软件进行
              方案均经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员                             模式识别，将总峰面积归一化后的数据通过Pareto⁃
              会批准（伦理审批号为 2016⁃027、2020⁃093）。                    scaling进行预处理后，采用多维统计分析方法⁃正交

              1.2  方法                                           偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares⁃
              1.2.1 代谢组学分析                                      discriminant analysis，OPLS⁃DA）模型处理有效数据，
                  样品采集与预处理：采集每位研究对象空腹静                          计算变量投影重要度（variable importance for the pro⁃
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