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第41卷第12期        李兰兰，陈     欣，张恒璐，等. 长链非编码RNA ENSMUST00000127391 对小鼠肾小球系膜细胞
                 2021年12月          增殖和纤维化的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（12）：1741-1746                  ·1743 ·


                后，一抗孵育4 ℃过夜，次日回收一抗，用TBST漂洗                        在室温避光处放置 15 min，加入 400 μL 1×Binding
                PVDF 膜后加入相应的二抗，室温下孵育 1 h 后用                       Buffer，混匀后在1 h内使用BD流式细胞仪检测结果。
                TBST漂洗。随后曝光显影。                                    1.3  统计学方法
                1.2.6 CCK8实验                                          实验结果使用 SPSS22.0 软件进行统计学分析
                    将 MMC 细胞分别以 2 000 个/孔的密度接种于                   和作图，实验数据以均数±标准差（x ± s）表示，CCK⁃
                96 孔板中，每孔加入 100 μL 完全培养基，每组设置                     8实验中两组间比较采用双因素方差分析检验（two⁃
                6个重复孔，共铺种5块板。放入37 ℃、5%CO2的培                       way ANOVA），考虑处理条件及时间两个因素的影
                养箱中培养，分别于24、48、72、96 h后取出，每孔各                     响，其余两组间比较采用 t 检验，P < 0.05 为差异有
                加入10 μL CCK8试剂，放入培养箱中孵育1 h，用酶                     统计学意义。
                标仪测定在450 nm波长处的吸光度值。
                                                                  2  结 果
                1.2.7 凋亡实验
                    将MMC细胞以5×10 个/孔的密度接种于6孔板                      2.1  lncRNA 127391在DN小鼠肾组织及高糖MMC
                                      5
                中，置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24 h 后，按照                   细胞中低表达
                BD Annexin V FITC Apoptosis Kit 凋亡试剂盒说明书              db/db组小鼠血糖、体重、尿量、24 h尿蛋白定量
                操作，细胞消化后离心，用预冷的 PBS 洗 2 遍，重悬                      较db/m对照组小鼠均显著升高，差异均有统计学意
                于 100 μL 1×Binding Buffer，随后分别加入 5 μL 的           义（P < 0. 05，表1）。
                Annexin V⁃FITC 和 5 μL PI 染色，轻轻混匀细胞，并                  HE 染色结果显示，与 db/m 小鼠相比，db/db 小

                                                  表1   db/m组和db/db组小鼠的特征
                                             Table 1 Characteristics of db/m and db/db mice
                    组别      n    性别     周龄      血糖（mmol/L）      体重（g）       尿量（mL）      24 h尿蛋白定量（μg/24 h）
                    db/m    3    雄性      9      11.80 ± 0.45  23.76 ± 0.21  0.67 ± 0.12       0.20 ± 0.03
                    db/db   3    雄性      9        ≥33.30      36.03 ± 0.39  12.17 ± 1.55      2.86 ± 0.33
                    P值                             <0.05         <0.05        <0.05             <0.05


                鼠表现出典型的DN病理改变，其系膜基质增生、基                           MMC细胞的增殖。
                底膜增厚（图 1A）。RT⁃qPCR 检测 lncRNA 127391               2.4  过表达lncRNA 127391促进MMC细胞凋亡
                相对表达量，结果显示，db/db 小鼠肾组织中 ln⁃                           通过流式细胞术检测细胞凋亡水平，结果显
                cRNA 127391 表达显著低于 db/m 小鼠肾组织（图                   示，过表达lncRNA 127391组的MMC细胞凋亡数显
                1B）。且随着葡萄糖浓度的升高，MMC 细胞中 ln⁃                       著高于对照组，表示 lncRNA 127391 可能促进 MMC
                cRNA 127391表达水平逐渐降低（图1C）。                         细胞凋亡（图4）。
                2.2 重组质粒pCDH⁃lncRNA127391转染MMC细胞
                                                                  3  讨 论
                    将空载对照 pCDH 和 pCDH⁃lncRNA 127391 分
                别转入MMC细胞后培养48 h，荧光显微镜观察到绿                             lncRNA 是一类参与多种生物学进程和疾病发
                色荧光表达（图2A）。RT⁃qPCR结果显示，转染重组                       展的非编码 RNA，其既可以定位于细胞核，也可以
                质粒 pCDH⁃lncRNA127391 后，MMC 细胞中 lncRNA             定位于细胞质。核 lncRNA 可通过多种方式介导表
                127391表达量显著高于对照组（图2B）。                            观遗传调控，包括表观转录和转录后修饰，调控方

                2.3  过表达 lncRNA 127391 抑制 MMC 细胞增殖和               式包括染色体修饰、转录干扰或转录激活。细胞质
                纤维化                                               中的 lncRNA 可以起到分子海绵的作用，与 microR⁃

                    蛋 白 质 免 疫 印 迹 结 果 显 示 过 表 达 lncRNA            NA结合，间接增强蛋白质的表达              ［17-18］ 。多项研究表
                127391 后，MMC 细胞中纤维化标志物 FN、Col⁃1 的                 明，lncRNA 影响了多种癌症的发展。有学者发现，
                蛋白表达量和增殖标志物 CyclinD1、PCNA 的蛋白                     lncRNA PCAT19 可以促进前列腺癌生长、侵袭和转
                表达量显著降低（图 3A）。CCK8 实验结果显示，过                       移 ［19］ 。在另一项研究中，研究人员发现，lncRNA
                表达 lncRNA 127391 组的 MMC 细胞增殖速度低于                  REG1CP 结直肠癌中表达显著上调，促进结直肠癌
                对照组（图 3C）。结果表明 lncRNA 127391 可抑制                  发生  ［20］ 。lnc00491可促进食管鳞癌细胞增殖和抑制
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