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第41卷第12期
               ·1742 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年12月


                  糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿             1.2  方法
              病的主要并发症之一，是终末期肾病的主要原因，                            1.2.1 动物实验
              增加了糖尿病患者的死亡率 。DN 的病理特征主                                8周龄雄性C57BL/KSJ 小鼠购自南京大学动物
                                        ［1］
              要表现为肾小球肥大，基底膜增厚，足细胞凋亡，细                           模式研究所，分为db/db组和db/m对照组，适应性喂
              胞外基质沉积等。研究表明，30%~40％的糖尿病患                         养 1 周后，测量体重血糖并用 ELISA 法检测 24 h 尿
              者并发DN。DN的发病因素多样，包括高血糖、晚期                          白蛋白定量（UAE），待 db/db 小鼠 UAE 显著升高
              糖基化终末产物、血管紧张素Ⅱ、氧化应激和促炎                            时，取小鼠肾组织，并行 HE 及 PAS 染色，确定 DN
                        ［2］
              细胞因子等 。由于DN具体发病机制较为复杂，目                           诊断  ［16］ 。本研究经南京医科大学动物护理与伦理
              前尚不明确，治疗方法有限，主要包括控制血糖、控                           委员会批准实施。
              制血压和控制血脂等，但众多 DN 患者仍然不可避                          1.2.2 细胞培养
              免地发展为终末期肾病 ，因此，探索 DN 的发病机                              为了模拟正常与糖尿病生理环境，将MMC细胞
                                   ［3］
              制和寻找其治疗靶点至关重要。                                    分别培养在葡萄糖浓度为 5、15、25 mmol/L 并含有

                  长 链 非 编 码 RNA（long non ⁃ coding RNA，ln⁃       10%胎牛血清的完全培养基中，置于 37 ℃、5%CO2
                                                         ［4］
              cRNA）是长度>200 个核苷酸的非编码长链 RNA 。                     的细胞培养箱中培养，每 2~3 d 换新鲜培养基。取
              研究表明，lncRNA 是多种生物过程的重要调节因                         生长良好的3~8代细胞行功能试验。
              子，广泛参与了增殖、纤维化、凋亡等生物学过程，                           1.2.3 质粒转染
              在乳腺癌、骨肉瘤和胃癌等癌症疾病和糖尿病等代                                 将 MMC 细胞分成对照组（pCDH）和过表达 ln⁃
              谢性疾病中发挥了重要作用              ［5-9］ 。Yin 等 ［10］ 发现 ln⁃  cRNA127391 组（lncRNA127391）。将 MMC 细胞按
                                                                         5
              cRNA TUG1可以调节胰岛β细胞功能，降低incRNA                     每孔1×10 个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入
              TUG1 的表达后β细胞凋亡率增加，胰岛素分泌减                          2 mL DMEM培养基。置于37 ℃、5%CO2的细胞培养
              少，从而调节糖尿病的发生。目前，lncRNA在DN中                        箱中静置过夜培养。按照 Lipofectamine 2000 说明
                                                                                                    TM
                              ［6］
                                                   ［11］
              的作用也逐渐显现 ，它可从影响肾纤维化 、介导肾                          书，将pCDH和pCDH⁃lncRNA127391分别转入MMC
                    ［12］
              脏炎症 、调节肾小球系膜细胞的增殖和凋亡 和足                           细胞中，置于细胞培养箱中静置培养6 h后，更换为
                                                      ［13］
              细胞损伤    ［14］ 等多方面参与DN的发生发展。本课题                    完全培养基，置于培养箱中继续培养 48 h 后，在荧
              组前期通过 lncRNA 芯片对 DN 小鼠和正常对照小                      光显微镜下观察，并收取细胞进行后续试验。
              鼠的肾组织进行差异 lncRNA 筛选，发现 lncRNA                     1.2.4 RT⁃qPCR试验
              127391 在 DN 小鼠中较正常小鼠表达显著降低，因                           TRIzol 试剂提取细胞和组织的总 RNA。按照
              此推测 lncRNA127391 可能在 DN 发生中发挥重要                   HiScript Ⅱ Q RT SuperMix（南京诺唯赞）试剂盒说
              作用，并于前期成功构建重组质粒 pCDH⁃lncRNA                       明书行逆转录反应生成 cDNA，参照 ChamQ SYBR
              127391 ［15］ 。 本 研 究 将 重 组 质 粒 pCDH ⁃ lncRNA       qPCR Master Mix（南京诺唯赞）试剂盒说明书行
              127391 转染小鼠肾小球系膜细胞（mice mesangial                 PCR 扩增，扩增条件：预变性 95 ℃ 30 s；循环反应
              cell，MMC）细胞，并观察MMC 细胞的增殖和纤维化                      95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 共 40 个循环；熔解曲线 95 ℃
              等指标的变化。                                           15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。LncRNA 127391 上游引
                                                                物 ：5′ ⁃ GCTCTAGAGCTATGATTTTTTTCATTGTAG⁃
              1  材料和方法
                                                                GTGAGCTCC ⁃ 3′ ，下 游 引 物 ：5′ ⁃ CGGGATCCC⁃
              1.1  材料                                           GGGATATTCATGTTGCTT⁃3′；β⁃actin 上游引物：5′⁃
                  MMC（中国科学院上海细胞库）；DMEM 培养                       GTGACGTTGACATCCGTAAAGA⁃3′，下游引物：5′⁃

              基、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；Lipofectamine            TM   GCCGGACTCATCGTACTCC⁃3′
              2000 脂质体（Invitrogen 公司，美国）；抗 FN 抗体、抗              1.2.5 蛋白质免疫印迹

              α⁃Tubulin抗体（Abcam 公司，美国）；抗Col⁃1、抗 Cy⁃                  在细胞样本中加入适量配制好的含有PMSF的
              clinD1 抗 体 、抗 PCNA 抗 体（Proteintech 公 司 ，美         蛋白裂解液，置于冰上，每10 min涡旋10 s，涡旋3次

              国）；CCK8 试剂盒（Dojindo 公司，日本）；Annexin V              后，4 ℃、13 000 r/min 离心 15 min，吸取上清至新的
              FITC Apoptosis Kit 凋亡检测试剂盒（BD 公司，美                1.5 mL EP 管中。将蛋白样品用 SDS⁃PAGE 电泳分
              国）。                                               离后，转至 PVDF 膜，用 5%脱脂奶粉溶液封闭 1 h
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