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第41卷第12期             周子欣，杨旭乐，张 许，等. 去泛素化酶YOD1调控肝脏脂代谢的初步研究［J］.
                 2021年12月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（12）：1735-1740                      ·1737 ·


                100 μL氯仿）。向管内加入等量异丙醇，轻柔混匀，                        牛奶溶液，将PVDF膜浸入，室温封闭60 min。
                静置10 min，10 000 g离心10 min，弃上清保留沉淀，                    取出预先以1%BSA抗体稀释液配置的一抗，置
                加入预冷的75%DEPC乙醇，10 000 g离心10 min洗                  于冰上，将 PVDF 膜置于塑封膜内，加入一抗，热合
                涤RNA沉淀，弃上清，晾干至乙醇挥发。加入DEPC                         封闭塑封膜，置于摇床上，4 ℃过夜，使一抗与目的
                水溶解沉淀，并使用仪器Nano drop测浓度。                          蛋白充分结合。次日，取出 PVDF 膜，回收抗体、洗
                    逆转录体系如下：总RNA 1 μg 与DEPC 水共计                   膜，并配置二抗。室温条件下，使 PVDF 膜结合二
                5.5 μL，反应液（5×）2 μL，RNA 酶抑制剂（20 U/μL）              抗，孵育 1 h，并洗膜。将 ECL 发光液均匀滴加在
                0.5 μL，dNTP 混合液（10 mmol/L）1 μL，随机引物               PVDF膜上，曝光。

                0.5 μL。逆转录程序如下：95 ℃预变性 1 min，95 ℃                 1.3  统计学方法
                变性10 s，60 ℃退火延伸1 min，返回上一步循环40次，                      数据均使用 Graphpad Prism 8.0 软件进行统计
                95 ℃变性1 min。取出cDNA样品，置于4 ℃保存。                     分析，并作图。所示数据均以均数±标准差（x ± s）的
                    Q ⁃ PCR 体 系 如 下 ：互 补 DNA（cDNA）1 μL，           形式表示。组间比较采用Student t检验，P＜0.05为
                SYBR Green染料5 μL，上游引物（2.5 mol/L）0.75 μL，          差异有统计学意义。

                下游引物（2.5 mol/L）0.75 μL，去离子水 2.5 μL。Q⁃
                                                                  2  结 果
                PCR程序如下：95 ℃预变性，10 min；95 ℃变性，15 s；
                60 ℃退火延伸，60 s；循环40次。                              2.1  短期高脂饮食降低C57BL/6小鼠肝脏中YOD1
                1.2.4 蛋白免疫印迹法                                     的表达水平
                    匀浆机、离心机 4 ℃预冷。配制组织裂解液，                            前期研究发现，高脂饮食喂养后，小鼠肝脏中
                4 ℃预冷。向EP内加入500 μL裂解液，切取小鼠肝                       的 YOD1 表达下降。基于此，首先检测了短期高脂
                脏组织，浸入其中，并匀浆。而6孔板细胞蛋白提取                           饮食的小鼠肝脏中 YOD1 的表达情况，并发现短期
                步骤如下：弃培养液，预冷 PBS 溶液轻柔洗去残留                         高脂饮食可降低C57BL/6小鼠肝脏中YOD1表达水
                培养液，加入适量裂解液，冰上裂解 30 min。随                         平（图 1A）。接下来，又检测了遗传性肥胖的 db/db
                后，10 000 g 离心 10 min，转移上清至洁净 EP 管                 小鼠肝脏，与db/+小鼠相比，YOD1的表达水平并未
                中。使用Thermo试剂盒测定蛋白浓度，以牛血清蛋                         观察到改变（图1B），提示YOD1的表达变化并非遗
                白为标准品绘制标准曲线，计算得到蛋白浓度。                             传因素所致。为了进一步明确YOD1是否受营养状
                    配制 10%SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶，过夜后使用。                      态调节，利用单不饱和脂肪酸油酸（oleic acid，OA，
                将上样缓冲液（5×）与蛋白样品混匀，金属浴95 ℃加                        200 μmol/L）处理Hepa1⁃6细胞16 h后，通过使用Q⁃
                热 10 min，蛋白充分变性后置于冰上，并逐一上样。                       PCR 检测 YOD1 的表达水平，发现经过 OA 处理后，
                调节电压至80 V，待样品通过浓缩胶后，增加电压至                         细胞内的YOD1表达水平显著下降（图1C）。
                120 V，继续电泳。结束后转膜，预先裁剪PVDF膜，                       2.2  YOD1的表达水平受营养状态调控
                甲醇激活后使用，贴合膜布与凝胶，并除气泡，以湿转                              为 了 明 确 YOD1 的 组 织 分 布 情 况 ，提 取 了
               “三明治”结构，在100 V、1 h的条件下转膜。配制5%                      C57BL/6小鼠多个组织器官的RNA。利用Q⁃PCR的

                              A   1.5                 B   1.2                C   1.5
                                 mRNA相对表达量  1.0  *       mRNA相对表达量  0.8         mRNA相对表达量  1.0  *






                                 YOD1  0.5               YOD1  0.4              YOD1  0.5
                                   0                       0                      0
                                     正常饮食 高脂饮食                 db/+  db/db           OA（-）  OA（+）
                   A：Q⁃PCR检测C57BL/6小鼠高脂饮食4周后肝脏组织中YOD1的mRNA水平，两组比较，P＜0.05（n=8）；B：Q⁃PCR检测正常饮食的8周龄
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                db/db小鼠肝脏组织中YOD1的mRNA水平（n=6）；C：Q⁃PCR检测200 μmol/L油酸处理Hepa1⁃6细胞16 h后，细胞中YOD1的mRNA水平，两组
                比较，P＜0.05（n=3）。
                    *
                                     图1   短期高脂饮食可降低C57BL/6小鼠肝脏中的YOD1的表达水平
                          Figure 1 Short⁃term HFD could reduce the expression level of YOD1 in the liver of C57BL/6 mice
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