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第41卷第12期
               ·1736 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年12月


              毒或其他明确病因的情况下，肝细胞内出现中性脂                            观察细胞内脂质堆积情况，检测下游相关基因，为
              肪堆积，主要为甘油三酯。作为一类进行性疾病，                            进一步揭示去泛素化酶YOD1在肝脏脂质代谢中的
              NAFLD 的病程可由非酒精性脂肪性肝炎发展为肝                          功能及作用提供新的实验数据。
              硬化、肝细胞癌，直至死亡            ［1-3］ 。肝脏作为脂类代谢
                                                                1  材料和方法
              的重要脏器，是脂肪酸、胆固醇和脂蛋白合成的枢
              纽，若β⁃氧化、极低密度脂蛋白分泌、脂肪酸合成等                          1.1  材料
              生物途径发生改变，或外周血非酯化脂肪酸（non⁃es⁃                            db/db 雄性小鼠、C57BL/6 雄性小鼠（北京维通
              terified fatty acid，NEFA）增加，均可引起脂肪肝。              利华实验动物技术有限公司），实验动物的使用及
                  不仅如此，肝脏脂代谢过程还受到更复杂的分                          操作均获得南京医科大学伦理委员会批准（批准编
              子网络调节。研究表明，固醇调节元件结合蛋白                             号：IACUC⁃1901025）。抗 Calnexin 抗体（Stress gen
             （sterol regulatory element⁃binding proteins，SREBP）家  公司，加拿大），抗Flag抗体、抗SREBP⁃1c抗体（Cell

              族包含由 2 个基因编码的 3 种蛋白。其中，SREBP1                     Signaling公司，美国），抗Insig⁃1抗体（Abcam公司，美
              基因在不同的启动子作用下可编码产生 SREBP⁃1a                        国）；蛋白marker（Bio⁃Rad 公司，美国）；TRIzol、转染
                                                                                   TM
              和SREBP⁃1c，而SREBP2基因则编码SREBP2。Shi⁃                 脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美国）；
                       ［4］
              momura 等 发现，SREBP⁃1c 是 SREBP 分布在小鼠                引物由上海捷瑞基因有限公司合成；甘油三酯检测
              和人类多个组织内的主要形式，在肝脏、白色脂肪、                           试剂盒（北京普利莱生物公司）；RevertAid First
              骨骼肌、肾上腺及脑组织中高表达，参与脂肪酸和                            Strand cDNA Synthesis Kit 逆 转 录 试 剂 盒（Thermo
              甘油三酯代谢；而 SREBP⁃1a 则主要分布在脾脏及                       Fisher 公司，美国）；SYBR Green Ⅰ Master（Roche 公
              小肠组织，参与调控细胞增殖及脂质代谢。SREBP                          司，瑞士）；脱脂奶粉（青岛MDBio公司）；Hepa1⁃6细
              在剪切后发挥作用。在内质网上，SREBP与SREBP                        胞（ATCC 细胞库，美国）；腺病毒（上海汉恒生物科
              裂解激活蛋白（SREBP cleavage⁃activating protein，         技有限公司）；60 kcal% 高脂饲料（D12492）（Re⁃
              SCAP）结合形成复合体，经过外壳蛋白复合物（coat                       search Diets公司，美国）。
              protein complex Ⅱ，COPⅡ）介导的囊泡运输，转移至                1.2  方法
              高尔基体，先后经过蛋白酶S1P、S2P的剪切，形成具                        1.2.1 动物分组和处理
              有活性的 SREBP 剪切体。多种脂质摄取及合成酶                              选取4周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为正常饮
              序列的启动子含有固醇调节元件（sterol regulatory                  食组及高脂饮食组，每组各8只，喂养4周后摘取肝
              element，SRE），SREBP 剪切体入核后可与 SRE 相结                脏组织   ［11］ 。对8周龄C57BL/6雄性小鼠进行饥饿再
              合，从而调节脂代谢         ［4-5］ 。                         喂食造模     ［12］ ，分别给予小鼠如下处理：正常饮食、饥
                  既往报道显示，去泛素化酶 YOD1 是卵巢肿瘤                       饿 24 h 以及饥饿 24 h 后再喂食 12 h，每组随机纳入
              相关蛋白酶（OTU）家族的一员，其UBX结构域可与                         6只小鼠，处理结束后摘取小鼠肝脏。
              含缬酪肽蛋白 VCP（又称 P97 或 CDC48）形成复合                    1.2.2 Hepa1⁃6细胞培养和处理
                                                  ［6］
              物，使折叠错误的蛋白从内质网上分离 。在酵母                                 在 5% CO2 的 37 ℃的环境下，给予 Hepa1⁃6 细
              细胞中，YOD1 的同源异构体 OUD1 可被 VCP 招募，                   胞 10%胎牛血清的高糖 DEME 培养基培养。以
              使转录因子STP23（哺乳动物NF⁃κB的同源物）去泛                       pcDNA3.3质粒为载体，构建YOD1过表达质粒。使
              素化而活化，从而调节酵母细胞内不饱和脂肪酸的                            用 Opti ⁃ MEM 培 养 基 稀 释 脂 质 体 Lipofectamine   TM
              稳态  ［7-8］ 。除了脂肪酸代谢外，研究还发现，YOD1参                   2000 与质粒，Lipofectamine   TM  2000 与质粒按照 2∶1
              与了免疫调节及肿瘤免疫等多种生物过程                    ［9-10］ 。本   的比例分别配置转染液并混匀，加入细胞培养基
              实验室前期研究发现，高脂饮食喂养后，小鼠肝脏                            内，转染细胞4~6 h后换液。
              中的 YOD1 表达下降。本研究为了探索 YOD1 在肝                      1.2.3 RNA提取和实时荧光定量PCR（Q⁃PCR）
              细胞营养代谢中的作用，分别检测了短期高脂饮食                                 匀浆机、离心机 4 ℃预冷。将 1 mL TRIzol 加入

              小鼠、db/db小鼠肝脏中以及经OA处理后的Hepa1⁃                      匀浆管内，置于冰上预冷。切取小鼠肝脏，加入
              6细胞内YOD1的表达水平，并观察了其在小鼠体内                          TRIzol 中匀浆。向匀浆管内加入200 μL氯仿，剧烈
              的组织分布以及小鼠在不同营养状态下的表达情                             震荡30 s，并静置5 min。12 000 g离心30 min，转移
              况，并在Hepa1⁃6细胞中过表达YOD1，经OA处理后                      上清至洁净EP管中（细胞RNA提取：500 μL TRIzol，
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