Page 32 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第12期
·1738 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年12月

100 μL氯仿）。向管内加入等量异丙醇，轻柔混匀， 牛奶溶液，将PVDF膜浸入，室温封闭60 min。 方法检测白色脂肪组织、棕色脂肪组织、肝脏、骨骼 A 40
静置10 min，10 000 g离心10 min，弃上清保留沉淀， 取出预先以1%BSA抗体稀释液配置的一抗，置 肌、肾脏和胰腺中 YOD1 的 mRNA 水平，发现 YOD1 *
加入预冷的75%DEPC乙醇，10 000 g离心10 min洗 于冰上，将 PVDF 膜置于塑封膜内，加入一抗，热合 在肝脏中表达丰度最高（图 2A），进一步提示 YOD1 （ mg/g蛋白 ） 30
涤RNA沉淀，弃上清，晾干至乙醇挥发。加入DEPC 封闭塑封膜，置于摇床上，4 ℃过夜，使一抗与目的 可能在肝脏中发挥重要作用。为验证YOD1是否参 20
水溶解沉淀，并使用仪器Nano drop测浓度。 蛋白充分结合。次日，取出 PVDF 膜，回收抗体、洗 与肝脏中的营养代谢，对 C57BL/6 小鼠进行禁食后 甘油三酯 10
逆转录体系如下：总RNA 1 μg 与DEPC 水共计 膜，并配置二抗。室温条件下，使 PVDF 膜结合二 再喂食处理，并观察到禁食24 h后，小鼠肝脏YOD1
5.5 μL，反应液（5×）2 μL，RNA 酶抑制剂（20 U/μL） 抗，孵育 1 h，并洗膜。将 ECL 发光液均匀滴加在 表达水平显著升高，再喂食后又显著下降（图 2B）。 0 空载对照组 YOD1过表达组
0.5 μL，dNTP 混合液（10 mmol/L）1 μL，随机引物 PVDF膜上，曝光。 上述结果提示，YOD1受营养状态调控，并可能参与 B 空载对照组 YOD1过表达组

0.5 μL。逆转录程序如下：95 ℃预变性 1 min，95 ℃ 1.3 统计学方法 肝脏营养代谢。
变性10 s，60 ℃退火延伸1 min，返回上一步循环40次， 数据均使用 Graphpad Prism 8.0 软件进行统计 2.3 过表达 YOD1 的 Hepa1⁃6 细胞中 OA 诱导的脂
95 ℃变性1 min。取出cDNA样品，置于4 ℃保存。 分析，并作图。所示数据均以均数±标准差（x ± s）的 质堆积明显减少
Q ⁃ PCR 体 系 如 下 ：互 补 DNA（cDNA）1 μL， 形式表示。组间比较采用Student t检验，P＜0.05为 为了进一步探索 YOD1 在肝细胞中的功能，通
SYBR Green染料5 μL，上游引物（2.5 mol/L）0.75 μL， 差异有统计学意义。 过构建YOD1质粒，在Hepa1⁃6细胞中过表达目的基

下游引物（2.5 mol/L）0.75 μL，去离子水 2.5 μL。Q⁃ 因，并给予Hepa1⁃6细胞OA处理。通过甘油三酯试
2 结 果
PCR程序如下：95 ℃预变性，10 min；95 ℃变性，15 s； 剂盒检测细胞中甘油三酯含量，结果显示与空载对 使用脂质体将 YOD1 质粒转染进入 Hepa1⁃6 细胞后，使用
200 μmol/L 的 OA 处理 Hepa1⁃6 细胞 16 h。A：利用甘油三酯试剂盒
60 ℃退火延伸，60 s；循环40次。 2.1 短期高脂饮食降低C57BL/6小鼠肝脏中YOD1 照组相比，过表达 YOD1 的 Hepa1⁃6 细胞内，甘油三
检测 Hepa1⁃6 细胞内甘油三酯含量，两组比较，P＜0.05（n=3）；B：
*
1.2.4 蛋白免疫印迹法 的表达水平 酯含量显著降低（图 3A）。同时，对经过 OA 处理后 Hepa1⁃6 细胞经过 OA 处理后，使用 10%多聚甲醛固定细胞，异丙醇
匀浆机、离心机 4 ℃预冷。配制组织裂解液， 前期研究发现，高脂饮食喂养后，小鼠肝脏中 的 Hepa1⁃6 细胞进行油红染色，镜下观察到过表达 溶液漂洗，使用油红染料在室温下染色10 min（×20）。
4 ℃预冷。向EP内加入500 μL裂解液，切取小鼠肝 的 YOD1 表达下降。基于此，首先检测了短期高脂 YOD1 的 Hepa1⁃6 细胞内，脂滴数量明显减少，且体 图3 过表达YOD1使OA处理后的Hepa1⁃6细胞内脂质明
脏组织，浸入其中，并匀浆。而6孔板细胞蛋白提取 饮食的小鼠肝脏中 YOD1 的表达情况，并发现短期 积亦变小（图3B），与细胞内甘油三酯含量的变化趋 显减少
步骤如下：弃培养液，预冷 PBS 溶液轻柔洗去残留 高脂饮食可降低C57BL/6小鼠肝脏中YOD1表达水 势相一致。 Figure 3 YOD1 overexpression reduced OA⁃induced lipid
培养液，加入适量裂解液，冰上裂解 30 min。随 平（图 1A）。接下来，又检测了遗传性肥胖的 db/db A accumulation in Hepa1⁃6 cell line
后，10 000 g 离心 10 min，转移上清至洁净 EP 管 小鼠肝脏，与db/+小鼠相比，YOD1的表达水平并未 2.4 过表达YOD1抑制SREBP⁃1c的剪切
中。使用Thermo试剂盒测定蛋白浓度，以牛血清蛋 观察到改变（图1B），提示YOD1的表达变化并非遗 4 由于过表达YOD1后，Hepa1⁃6细胞内的甘油三
白为标准品绘制标准曲线，计算得到蛋白浓度。 传因素所致。为了进一步明确YOD1是否受营养状 mRNA相对表达量 5 3 酯含量显著下降，且脂质堆积明显减少。因此，初步
配制 10%SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶，过夜后使用。 态调节，利用单不饱和脂肪酸油酸（oleic acid，OA， 2 推测，过表达YOD1后，可能引起Hepa1⁃6细胞中脂质
将上样缓冲液（5×）与蛋白样品混匀，金属浴95 ℃加 200 μmol/L）处理Hepa1⁃6细胞16 h后，通过使用Q⁃ YOD1 1 合成减少。根据文献报道，SREBP家族的蛋白分子
热 10 min，蛋白充分变性后置于冰上，并逐一上样。 PCR 检测 YOD1 的表达水平，发现经过 OA 处理后， 0 SREBP⁃1c作为转录因子，经过剪切入核后，通过结合
棕色脂肪组织
调节电压至80 V，待样品通过浓缩胶后，增加电压至 细胞内的YOD1表达水平显著下降（图1C）。 肝脏 骨骼肌 肾脏 胰腺 启动子含有SRE序列的下游基因，可以激活乙酰辅酶
120 V，继续电泳。结束后转膜，预先裁剪PVDF膜， 2.2 YOD1的表达水平受营养状态调控 白色脂肪组织 A羧化酶、脂肪酸合成酶以及甘油⁃3⁃磷酸酰基转移酶
甲醇激活后使用，贴合膜布与凝胶，并除气泡，以湿转 为 了 明 确 YOD1 的 组 织 分 布 情 况 ，提 取 了 B 等关键酶，从而促进脂肪酸及甘油三酯的合成 。
［4］
mRNA相对表达量 4 3 2 用 OA（200 μmol/L）处理16 h后，通过蛋白免疫印迹
“三明治”结构，在100 V、1 h的条件下转膜。配制5% C57BL/6小鼠多个组织器官的RNA。利用Q⁃PCR的 * ** 据此，首先在Hepa1⁃6细胞内过表达YOD1并使
法检测其表达效率，可知YOD1过表达成功（图4A）。
进一步检测细胞内SREBP⁃1c的mRNA水平，与空载

YOD1 1 对照组相比，过表达YOD1后，SREBP⁃1c的总mRNA
0 水平并未观察到变化（图4B）。由于SREBP⁃1c蛋白
正常饮食 禁食 禁食后喂食 需要先后在内质网、高尔基体上经过剪切，才能以
［4-5］
A：Q⁃PCR检测YOD1的组织分布情况；B：Q⁃PCR检测正常饮食、 具有活性的剪切体形式入核发挥作用 。接下来，
进一步通过蛋白免疫印迹法检测SREBP⁃1c的蛋白表
禁食 24 h、禁食后再喂养 12 h 的 C57BL/6 小鼠肝脏组织中 YOD1的
达水平，发现过表达YOD1后，SREBP⁃1c前体的表达
mRNA水平，两组比较，P＜0.01，P＜0.001（n=6）。
*
**
图2 YOD1在C57BL/6小鼠肝脏中的表达受营养状态调控 水平没有变化，但是SREBP⁃1c剪切体表达水平明显
Figure 2 The expression of YOD1 in C56BL/6 mice was 降低（图 4C）。提示过表达 YOD1 抑制 SREBP⁃1c 的
regulated by nutritional status 剪切，从而影响下游脂代谢。