Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第10期
·1366 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年10月
［15-16］
应保持垂直于爪的作用侧约 6~8 s 。撤出阈值 1.2.4 酶联免疫吸附实验（enzyme⁃linked immuno⁃
数据以 g 为单位确定为爪撤出阈值（paw withdrawal sorbent assay，ELISA）
thresholds，PWT）。 为了检测小鼠血清炎症因子的表达水平，采用
1.2.2.2 热痛敏感性测试 血清分离管分离血清，使血样室温凝集30 min，然后
使用热板测试所有小鼠的爪缩回潜伏期（paw 1 000 g 离心 15 min。吸取血清样本之后即刻用于
retraction latency，PWL），以评估小鼠的热痛敏感 检测。使用酶联免疫试剂盒测定各组小鼠血清炎
性。如 Li 等 ［17］ 报道，热板由 25 cm×25 cm 的金属板 症细胞因子TNF⁃α、IL⁃1β和IL⁃6的含量。
和带玻璃的笼子组成。在测试之前，将每只小鼠放 1.2.5 蛋白免疫印迹
置在热板装置中 10 min，以使其在不加热的情况下 向各组小鼠 DRG 加入组织裂解液并于匀浆器
适应。应确保小鼠的两个后爪在不施加任何力的 中低温匀浆，将组织裂解液置于12 000 r/min，4 ℃离
情况下轻轻接触板的表面，并且将热板设置在 心 5 min。采用 BCA 法测定各组样本蛋白浓度，向
55 ℃，截止时间为30 s。疼痛反应通过小鼠抖动、缩 蛋白裂解液中加入SDS上样缓冲液并煮沸变性。蛋
回或舔脚掌的反应时间来界定，每隔15 min进行重 白样品经 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至
复测量，小鼠热痛敏感性程度的量化根据 3 次重复 PVDF膜，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入兔抗
测量试验的平均值来确定。 小鼠 TRPV1（ab6166）、TRPV4（ab39260）和 GAPDH
1.2.3 逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（reverse （ab9485）一抗（1∶1 000），于4 ℃过夜孵育，羊抗兔二
transcription quantitative PCR，RT⁃qPCR） 抗（ab205718）（1∶3 000）室温孵育 2 h。滴加发光
在 CFA 注射后第 4 天，以 50 mg/kg 的大黄素 液，使用天能 ECL 发光仪捕获蛋白条带，Image J 软
溶液对小鼠进行腹腔注射，并在大黄素腹腔注射4 h 件测定蛋白条带灰度值，与内参GAPDH 比较，计算
后收集各组小鼠L4~L6 DRG。DRG收集方法如下： 目的蛋白的相对表达水平。
剪开小鼠背部皮肤，分离脊柱两旁的肌肉，用咬骨 1.3 统计学方法
钳轻轻剥去棘突及两侧横突，暴露脊髓后，用镊子 所有数据统计分析和绘图均在 GraphPad Prism
挑起脊髓可看到脊神经后根及其椎管处膨大的 8 中处理。实验数据表示为均数±标准差（x ± s），
DRG，收集 CFA 组和 Sham 组小鼠 L4~L6 DRG。使 Student’s t 检验用于比较两组间差异，单因素或重
用TRIzol 提取每个样品的总RNA，并通过分光光度 复测量的方差分析用于多组间或不同时间点间比
法对每个样品的 RNA 浓度进行定量。使用 Primer⁃ 较，P < 0.05为差异有统计学意义。
Script MT RT Master Mix 试剂盒将每个样品 1 μg 总
2 结 果
RNA 反转录为 cDNA，然后进行 qPCR 实验。根据
® TM 2.1 建立CFA诱导的小鼠炎性疼痛模型
SYBR Premix Ex Taq 试剂盒操作步骤准备 qPCR
反应体系。将qPCR反应体系在95 ℃下孵育3 min， 为了建立小鼠炎性疼痛模型，将 25 μL CFA 注
然后将目标基因片段在 95 ℃下 10 s 和 58 ℃下 10 s 射到8周龄C57BL/6小鼠后爪的足背侧。注射后数
扩增40个循环。qPCR实验中所使用的引物序列来 小时，可在注射部位观察到明显的局部炎症迹象
自Primer Bank在线网站，并使用NCBI Primer⁃BLAST （如红紫色肿胀）。与Sham组相比，CFA组在机械敏
进行引物特异性验证，具体序列如下：TNF⁃α正向引 感性（图1A）和热敏感性（图1B）测试中的疼痛阈值
物 5′⁃CAGGCGGTGCCTATGTCTC⁃3′，反向引物 5′⁃ 在 CFA 注射后的第 1 天显著降低（P < 0.001），并持
CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG⁃3′。IL⁃1β正向引 续到第 7 天。结果表明，成功建立了 CFA 诱导的小
物 5′⁃CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG⁃3′，反向 鼠炎性疼痛模型。
引物5′⁃GATCCACACTCTCCAGCTGCA⁃3′。IL⁃6 正 2.2 大黄素以剂量依赖方式缓解 CFA 引起的炎性
向引物 5′⁃CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC⁃3′，反向引 疼痛
物 5′ ⁃ CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT ⁃ 3′。GAPDH 为了评估大黄素对炎性疼痛的镇痛作用，在
正向引物 5′⁃AGGTCGGTGTGAACGGATTTG⁃3′，反 CFA注射后第4天，分别以5、25、50、100 mg/kg的大
向引物 5′⁃GGGGTCGTTGATGGCAACA⁃3′。根据公 黄素溶液对小鼠进行腹腔注射，并在大黄素腹腔注
式 2 -ΔΔCt 计算基因的表达水平，并将 GAPDH 基因的 射 2 h 后评估小鼠的机械疼痛阈值和热痛敏阈值。
表达水平用作内部对照。 机械疼痛敏感性测试结果表明，腹腔注射大黄素可
