Page 58 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
               ·810 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年6月


             （brown adipose tissue，BAT）、白色脂肪组织（主要是              70 Hz，120~180 s，按说明书抽提 RNA，OneDrop 微
              附 睾 白 色 脂 肪 ，epididymal white adipose tissue，     量分光光度计进行定量及纯度分析。
              eWAT）和米色脂肪组织（主要是腹股沟脂肪组织，                               用5×HiScript Ⅱ qRT Super Mix逆转录为 cDNA，
              inguinal white adipose tissue，iWAT） 。BAT 主要由      -20 ℃保存。
                                             ［6］
              棕色脂肪细胞组成，含有丰富的血管和高度神经支                                 用去离子水 10 倍稀释 cDNA，实时荧光定量
              配，是机体非战栗性产热的主要器官 ；eWAT 的主                         PCR 按照稀释后的cDNA 4.6 μL，SYBR Green 5 μL，
                                               ［7］
              要功能是储存和释放能量，血管和神经分布最少；                            上、下游引物（10 mmol/L）各 0.2 μL，混匀，反应在
              iWAT 在腹股沟区较为明显，交感神经纤维相对                           ThermoFisher Quant Studio5荧光定量PCR仪上进行，
                      ［8］
              BAT 较少 。iWAT 中除脂肪细胞外还存在一些免                        反应程序为：预变性 95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃
                                                   ［9］
              疫细胞，比如嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等 。iWAT                          30 s，40 个循环；熔解曲线：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，
              响应寒冷和其他某些刺激而出现适应性改变，称为                            95 ℃ 15 s。以 2 -ΔΔCT 计算目的基因相对表达量。
                                                    ［11］
              适应性产热     ［6，10］ ，这一过程伴随着神经重塑 。在肥                      目的基因和内参引物如下：解偶联蛋白 1（un⁃
              胖个体中，脂肪组织呈现出慢性、低度炎症的状态，其                          coupling protein 1，Ucp⁃1）上游引物 5′⁃AGGCTTC⁃
              中巨噬细胞呈现出促炎性M1型极化的状态                    ［12］ 。冷    CAGTACCATTAGGT⁃3′，下游引物 5′⁃CTGAGTGAG⁃
              刺激后 iWAT 中嗜酸性粒细胞、巨噬细胞被选择性                         GCAAAGCTGATTT⁃3′；细胞死亡诱导 DNA 片段化
              激活，选择性激活的巨噬细胞可以通过分泌儿茶酚                            因子样效应子 A（cell death inducing DFFA like effec⁃
              胺增加脂解、促进适应性产热                ［13］ 。与 BAT 相比，      tor A，Cidea）上游引物 5′⁃TGCTCTTCTGTATCGCC⁃
              iWAT 具有更大的表型灵活性，可以根据外界环境                          CAGT ⁃ 3′ ，下 游 引 物 5′ ⁃ GCCGTGTTAAGGAATCT⁃
              调整产热或脂质储存表型。BAT和iWAT能够增加                          GCTG⁃3′；过氧化物酶体增殖受体γ共激活因子 1α
              能量消耗、促进产热，有益于探究肥胖及其相关代                            （peroxisome proliferator⁃activated receptor gamma co⁃
              谢综合征的治疗。                                          activator 1⁃α，Ppargc1α）上游引物 5′⁃AGCCGTGAC⁃
                  本研究通过观察C57BL/6J小鼠3种脂肪组织对                      CACTGACAACGAG⁃3′，下游引物 5′⁃GCTGCATG⁃
              冷刺激响应的区别，为研究冷刺激条件下脂肪组织                            GTTCTGAGTGCTAAG⁃3′；内 参 基 因β⁃actin上游引
              功能及作用机制提供基础。                                      物 5′⁃GTTGGTTGGAGCAAACATC⁃3′，下游引物 5′⁃
                                                                CTTATTTCATGGATACTTGGAATG⁃3′。
              1  材料和方法
                                                                1.2.3 Western blot
              1.1  材料                                                各脂肪组织加裂解液后匀浆，冰上充分裂解
                  10 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠购于南京医科大学                   后，4 ℃ 12 000 g 离心 10 min，转移上清至新 EP 管
              医药实验动物中心，体重24~28 g，实验动物的饲养、                       中。加入5×SDS上样缓冲液，变性后电泳，转膜，室
              使用和操作均获得南京医科大学医药实验动物中心                            温封闭1 h，一抗过夜，孵育二抗，ECL化学发光法检
              伦理委员会批准（伦理审批号为 IACUC⁃1901036）。                    测蛋白表达。
              蛋白 marker（ThermoFisher 公司，美国），逆转录试                1.2.4 流式细胞术
              剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），SYBR                                脂肪组织用消化酶消化，细胞过筛，离心后重
              Green（上海翌圣生物科技股份有限公司），引物由                         悬 1 次，再次离心，Fc 受体封闭液封闭，加入相应抗
              苏州金唯智生物科技有限公司合成。                                  体 anti⁃CD45⁃PE/Cy7、anti⁃CD11b⁃PerCP/Cy5.5、anti⁃

              1.2  方法                                           F4/80⁃AF488、anti⁃CD11c⁃APC，孵育 30 min。流式
              1.2.1 动物分组和处理                                     细胞染色缓冲液洗涤，细胞活性染料染色。离心去
                  将小鼠适应性喂养 1 周，待小鼠体征稳定后随                        染料，重悬细胞，加入固定剂，室温下避光孵育。洗
              机分为 2 组：对照组和冷刺激组。对照组小鼠喂养                          涤后离心弃上清，重悬细胞。加入破膜剂和 anti⁃
              于室温（22 ℃）环境；冷刺激组小鼠于6 ℃环境饲养，                       CD206⁃PE，避光孵育后洗涤，离心弃上清，再涡旋使
              两组均单笼单只。                                          细胞完全重悬，用 0.1%甲醛固定，2~8 ℃避光保存，
              1.2.2 RNA提取及相对定量分析                                并在24 h内对固定的细胞进行分析。

                  取 20~30 mg 小鼠脂肪组织，加 500 μL RNA⁃               1.3 统计学方法
              easy Isolation Reagent 在高速组织研磨仪中研磨，                    所有数据均使用 Excel 进行统计学分析。定量
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