Page 28 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第12期
               ·1644 ·                         南   京 医 科       大 学      学 报                        2023年12月


                  支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia           当于青春期，研究显示小鼠肺部菌群在 5~6 周龄时
              BPD）是早产儿最常见的慢性肺病之一 。BPD 本                         多样性更高，6~8周龄时保持稳定 。
                                                  ［1］
                                                                                              ［9］
              质是在遗传易感性的基础上，氧中毒、气压伤或容                            1.2.2 样本采集
              量伤以及感染或炎症等各种不利因素对发育不成                                  生后第 43 天小鼠经 100% CO2吸入法处死，无
              熟肺（囊泡期或早期肺泡期）导致的不同程度的肺泡                           菌条件下开胸，取肺叶组织，用无菌PBS冲洗。右肺
              间隔损伤、肺纤维化及异常血管发育和重塑等 。尽                           上叶用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，厚
                                                      ［2］
              管产前预防性皮质类固醇激素的使用，生后气管内表                           度为 4 μm，制备 HE 染色病理切片，其余肺组织立
              面活性物质替代治疗，保护性的通气策略和目标氧饱                           即在液氮中冷冻，转移至-80 ℃冰箱保存。
                                                     ［3］
              和度策略等都极大提高了 BPD 患儿生存率 ，但是                         1.2.3 肺部组织微生物区系分析
              BPD 患儿在其成长过程中会出现持续的肺功能恶                                样品 16S rDNA 检测由南京枫梓生物医药科技
              化，反复呼吸道感染，以及因呼吸道疾病再入院的                            有限公司完成，选取细菌 16S rRNA 基因 V3~V4 可
              风险增加，并可能在成年时期发展为慢性阻塞性肺疾                           变区进行 PCR 扩增。通过对测序序列（reads）进行
              病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 。   拼接、质控和过滤，以97%的相似度聚类为分类操作
                                                         ［4］
              随着非培养方法鉴定细菌技术的成熟及运用，已可                            单元（operational taxonomic units，OTU），利用 RDP
                                       ［5］
              在肺部检测出微量细菌定植 。越来越多的证据表                            classifier 对每条序列进行物种分类注释            ［10］ ，根据物
              明，BPD 患儿会受到肺部微生物菌群失调的影响，                          种注释情况进一步分析 Alpha 多样性、Beta 多样性、
                                             ［6］
              并可能与疾病的发生和发展有关 。目前对 BPD                           物种丰度。
              患儿肺部菌群的研究更多关注疾病早期 ，缺乏对                            1.2.4 肺组织形态分析及肺损伤病理学评估
                                                  ［7］
              远期特点的相关研究。此外，有研究显示 BPD 存                               根据本实验室之前的方法，计算辐射状肺泡计
                                  ［8］
              在性别易感性的差异 。本研究通过高通量测序                             数（radical alveolar count，RAC）值评估肺泡化程度，
              探究高氧暴露 BPD 模型小鼠青春期（生后 6 周）肺                       由光学显微镜采集图像，以双盲方式光学显微镜下
              部菌群的特点及性别因素对其影响。                                  每张切片随机选取 6 个视野进行观察并测量 RAC，
                                                                最终取平均值，并进行组间比较。
              1  材料和方法
                                                                1.3  统计学方法
              1.1  材料                                                采用 SPSS25.0 统计软件进行分析。实验数据
                  32 只出生时间相差 30 min 以内的新生 C57BL/                以均数±标准差（x ± s）表示，两组间用独立样本t 检
              6J 小鼠（SPF 级），购自南京医科大学医药动物实验                       验进行比较分析，多组间比较采用双因素方差分
              中心，饲养于南京医科大学附属淮安第一医院动物                            析。Anosim 相似性分析可检验组间差异是否大于
              实验中心。环境温度恒定（24±2）℃，相对湿度60%~                       组内，判断实验分组是否存在意义。P<0.05为差异
              70%，昼夜光照各 12 h，自由饮水及采食，饮水及饲                       有统计学意义。
              料由动物中心提供。本实验已获得南京医科大学
                                                                2  结 果
              附属淮安第一医院伦理委员会批准（批号：DW⁃P⁃
              2023⁃001⁃06）。                                     2.1 肺部组织病理改变
              1.2 方法                                            2.1.1 小鼠肺组织病理
              1.2.1 实验分组                                             两组空气组小鼠肺泡结构正常，大小均匀，肺
                  32 只 C57BL/6J 新生小鼠，分为 4 组，每组 8 只，             泡壁及支气管结构正常；两组高氧组肺泡结构不规
              即空气雌性组（Ⅰa）、空气雄性组（Ⅰb）、高氧雌性组                        则，肺泡间隔断裂及炎性细胞浸润，支气管壁增厚
             （Ⅱa）、高氧雄性组（Ⅱb）。高氧组小鼠生后即置于                          （图1A）。
              吸入氧浓度>95%的环境中 7 d，空气组小鼠置于同                        2.1.2 RAC值
              室内空气（FiO2=21％）环境；母鼠每24 h在高氧组和                          高氧组RAC 值下降（P < 0.001）；双因素方差分
              空气组之间轮换，以避免母鼠出现氧中毒。之后高                            析显示性别对小鼠 RAC 变化无显著差异（F=2.001，
              氧及空气组新生小鼠与各自母鼠饲养在相同空气                             P=0.173，图1B）。
              环境下直至 6 周，且所有小鼠在此期间所食饲料完                          2.2 肺部菌群测序数据质控与OTU分析
              全相同。6 周龄小鼠其身体各个器官逐渐成熟，相                                共 32 例小鼠肺部标本进行 16S rDNA 基因测
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