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第44卷第9期 王 程，顾慧慧，宣 亮，等. DF3/MUC1启动子调控的重组腺病毒的构建及循环肿瘤细胞检测
2024年9月 效果的鉴定［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（9）：1190-1197，1226 ·1191 ·

hTERT⁃copGFP method（69.6%）. In clinical CTC detection，the number of CTC detected by the Ad⁃DF3⁃copGFP method［（10.90±
2.42）cells per 4 mL］was significantly higher than that by the Ad⁃hTERT⁃copGFP method［（6.20±1.81）cells per 4 mL，P < 0.001］.
Conclusion：The recombinant adenovirus（Ad ⁃ DF3 ⁃ copGFP）is successfully constructed，demonstrating a reliable and efficient
detection of CTC，thus providing a new method for CTC detection.
［Key words］ circulating tumor cell；DF3/MUC1；adenovirus
［J Nanjing Med Univ，2024，44（09）：1190⁃1197，1226］

转移是引起恶性肿瘤相关死亡的主要原因 。 ⁃4FP、pUC57⁃DF3、pDC316、pBHGlox△E1，3Gre 及
［1］
从原发肿瘤或转移性肿瘤脱落到外周血中的游离 pTC⁃E1A⁃P2A⁃E1B 质粒（本实验室保存）；Polyplus

肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞（circulating tumor jetPRIME（Polyplus公司，法国）；DMEM高糖培养基、
cell，CTC） ，其在肿瘤转移过程中扮演重要角色， 胎牛血清、胰酶（Hyclone公司，美国）；限制性内切酶
［2］
因此 CTC 的检测及分析对于了解转移的生物特性 XbaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、PacⅠ（Thermo公司，美国）；
［3］
及发展抗转移治疗具有重要意义 。 T4 DNA 连接酶、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒
黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）基因是最先被发现的 （Takara 公司，日本）；Adeno⁃X 病毒纯化试剂盒
TM
［4］
黏蛋白家族成员之一 ，其所编码的Ⅰ型跨膜糖蛋 （BD Biosciences公司，美国）。
白在大多数腺上皮和导管上皮（如肺、乳腺、前列 1.1.2 临床标本收集
腺、胃肠道等）中都有表达 。MUC1 的启动子序列 静脉血液样本采集对象：10例原发性肺癌患者
［5］
总长约为 2.9 kb，其中顺式作用元件主要位于 5′的 为南京市第二医院肿瘤科2023年收治（临床及病理
743 bp 序列内 ［6⁃7］ 。启动子包含许多潜在的转录调 确诊为非小细胞肺癌、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期）、5例健
控因子结合位点，包括 Sp1、AP1⁃4、NF⁃κB、E⁃box 和 康对照为体检中心志愿者。本研究通过南京市第
GC盒等，其中Sp1 、NF⁃κB 在许多肿瘤中过表达， 二医院伦理审批（编号：2016⁃LY⁃kt038），所有患者
［8］
［9］
如肺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等，AP1⁃4在乳腺癌、 对本研究均知情同意。
［10］
结肠癌和间变性大细胞淋巴瘤等中过表达 。MUC1 1.2 方法
在多种肿瘤组织中均异常高表达 ［11］ ，这一特征使 1.2.1 骨架质粒pBHG⁃Ad5⁃DF3⁃copGFP的构建
MUC1蛋白可作为肿瘤诊断及预后的标志物之一。有 以pUC57⁃DF3为模板，XbaI⁃DF3⁃F/EcoRI⁃DF3⁃R
研究证明在MUC1阳性的肿瘤细胞中，MUC1的转录 为引物（表 1），PCR 扩增 DF3 片段（786 bp），PCR 产
调控序列可介导目的基因选择性表达 。 物与 pDC316 双酶切（XbaⅠ+EcoRⅠ）后连接，得到
［12］
本研究设计一款含有DF3/MUC1启动子转录调 pDC⁃DF3，以DF3为检测条带，XbaⅠ⁃DF3⁃F/pDC316⁃R
控序列和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， 为引物，PCR 鉴定（967 bp）并测序验证。以 pDC⁃
GFP）基因的重组腺病毒（Ad⁃DF3⁃copGFP），该病毒 2insX⁃hTERTp△⁃CMV⁃copGFP⁃4FP为模板，EcoRⅠ⁃
在感染细胞后，能在 DF3/MUC1 转录环境作用下启 copGFP⁃F/HindⅢ⁃copGFP⁃R为引物，PCR扩增copGFP
动下游copGFP基因的表达，从而进行CTC示踪。本 片段（759 bp），PCR 产物与 pDC⁃DF3 双酶切（EcoR
研究使用Ad⁃DF3⁃copGFP与本实验室构建保存的含 Ⅰ+HindⅢ）后连接，得到 pDF3⁃copGFP，以 copGFP
人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse tran⁃ 为检测条带，EcoRⅠ⁃copGFP⁃F/pDC316⁃R 为引物，
scriptase，hTERT）启动子腺病毒（Ad⁃hTERT⁃copGFP） PCR鉴定（922 bp）并测序验证。
进行对比研究，评价其在CTC检测方面的效果。 以pDF3⁃copGFP为模板，PacⅠ⁃DF3⁃F/PacⅠ⁃TC⁃R
为引物，PCR 扩增 DF3⁃copGFP 片段（1 745 bp），
1 材料和方法
PCR 产物与 Pac Ⅰ单酶切线性化的 pBHGlox△E1，
1.1 材料 3Cre骨架质粒同源重组，得到pBHG⁃Ad5⁃DF3⁃copGFP，
1.1.1 细胞系及主要试剂 以DF3⁃copGFP为检测条带，PacⅠ⁃DF3⁃F/VECTOR⁃R
人胚肾细胞系HEK293、人肺腺癌细胞系A549、 为引物，PCR鉴定（2 091 bp）并测序验证。

H1299（本实验室保存）；感受态细胞 DH5α、Ad⁃ 1.2.2 穿梭质粒pDF3⁃E1A⁃P2A⁃E1B的构建
hTERT⁃copGFP、pDC⁃2insX⁃hTERTp△⁃CMV⁃copGFP 以pTC⁃E1A⁃P2A⁃E1B为模板，MC⁃F/SalⅠ⁃E1B⁃R