Page 22 - 南京医科大学自然版

第44卷第9期
·1194 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年9月

A M 1 B M 1 2 A MOI=1
bp bp 100
MOI=3
2 000 80 MOI=5
MOI=10
1 500 ←1 671 bp （%）
2 000 1 000 60
1 500 ←1 521bp cells
1 000 750 40
500
750 GFP +
500
20
C TTACGCACAGCAGAAAAATCTTCCAAACACTCCCAAGCCTCCATGGTGGCGTCTAGCGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATC
0
0 8 16 24 32 40 48
Time after infection（h）
B
710 720 730 740 750 760 770 780 MOI=1
100
PCR amplification products（A），PCR identification（B），and se⁃ MOI=3
quencing chromatogram（C）. A：E1A ⁃ P2A ⁃ E1B fragments；M：DNA 80 MOI=5
MOI=10
marker，1：PCR fragments. B：Plasmid identification for pDF3⁃E1A⁃P2A⁃ （%） 60
E1B，all showing positive clones. M：DNA marker，1，2：PCR results of cells 40
GFP +
clones. C：Partial DNA sequencing results for pDF3⁃E1A⁃P2A⁃E1B.
图2 PCR产物、PCR鉴定及穿梭质粒测序图谱 20
Figure 2 PCR products，PCR identification，and shuttle 0
plasmid sequencing diagram 0 8 16 24 32 40 48
Time after infection（h）
Infectivity rates of A549 cells post⁃infection with Ad⁃DF3⁃copGFP
Bright field GFP
（A）and Ad⁃hTERT⁃copGFP（B）were assessed under varying MOI and
infection duration（n=5）.
图4 感染条件优化
Figure 4 Optimization of infection conditions

1.30）、（31.80±3.56）、（59.00±5.14）、（138.20±8.58）个，
线 性 回 归 模 型 分 析 得 出 检 出 率 分 别 为 77.3%
（Ad⁃DF3⁃copGFP 法）和 69.6%（Ad⁃hTERT⁃copGFP
图 3 在 HEK293 细 胞 中 重 组 腺 病 毒 的 包 装（ 比 例 尺 = 法）。且分析结果表明，检测到的 CD45 /GFP 细胞
-
+
100 μm，×100） 与CTC模型中的肿瘤细胞数量存在相关性，Ad⁃DF3⁃
Figure 3 The packaging of recombinant adenovirus in
2
2
copGFP模型R =0.988 5，Ad⁃hTERT⁃copGFP模型R =
HEK293 cells（scale bar=100 μm，×100）
0.984 6（图7）。证明重组腺病毒Ad⁃DF3⁃copGFP相
染效率高。 比 Ad⁃hTERT⁃copGFP，具有更高的模拟CTC检出率
2.6 非特异性感染率测定 （P < 0.05）。
Ad⁃DF3⁃copGFP 与 Ad⁃hTERT⁃copGFP 的非特 2.8 CTC检测效果鉴定
异性感染率分别为 0.047%与 0.625%（P < 0.001，图 两种病毒都成功在非小细胞肺癌患者外周血
6），说明通过采用 DF3 启动子替换 hTERT 启动子， 中检测到 CTC，Ad⁃DF3⁃copGFP 法检出肿瘤细胞数
有效地抑制了病毒在 PBMC 中的非特异性感染，进 为每 4 mL（10.90±2.42）个，Ad⁃hTERT⁃copGFP 法检
一步证明本研究构建的重组腺病毒在检测 CTC 方 出肿瘤细胞数为每 4 mL（6.20±1.81）个，Ad⁃DF3⁃
面具有更高的特异性，使准确检测CTC而不产生假 copGFP 法检出的肿瘤细胞数明显高于 Ad⁃hTERT⁃
阳性成为可能。 copGFP 法（P < 0.001，图 8），由此可见重组腺病毒

2.7 两种病毒对模拟CTC的检出率对比 Ad⁃DF3⁃copGFP 能检出更多的 CTC，证明其临床
在外周血中分别加入 10、50、100、200 个 A549 CTC 检测效果更突出。
细胞以模拟CTC，两种病毒都成功检测到肿瘤细胞，
3 讨 论
Ad⁃DF3⁃copGFP 法检出细胞数分别为（6.20±0.84）、
（33.20±3.27）、（680.80±5.59）、（152.20±9.78）个， 肿瘤转移是指肿瘤细胞在远离其原发器官的
Ad⁃hTERT⁃copGFP 法检出细胞数分别为（5.80± 远端器官中生长的一种现象，是导致肿瘤患者死亡的