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第44卷第9期 王 程，顾慧慧，宣 亮，等. DF3/MUC1启动子调控的重组腺病毒的构建及循环肿瘤细胞检测
2024年9月 效果的鉴定［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（9）：1190-1197，1226 ·1193 ·

4 mL，Ficoll 密度梯度离心法进行血液预处理，按
2 结 果
MOI=3 比例配制两种病毒胶液，加入病毒胶液的血
样接种于6孔板中，37 ℃放置，按要求进行Hoechst染 2.1 骨架质粒pBHG⁃Ad5⁃DF3⁃copGFP的构建
-
色与多聚甲醛胶固定，24 h 时 HCS 成像计数 CD45 / DF3、copGFP 及 DF3⁃copGFP 经 PCR 扩增后，产
GFP 细胞后，通过箱线图及散点图进行数据分析。 物经凝胶电泳，DNA片段大小分别为786 bp、759 bp、
+
1.3 统计学方法 1 745 bp，与目的基因相符（图 1A~C）；以重组质粒
使用软件Rstudio及GraphPad Prism 8进行统计 pDC⁃DF3、pDF3⁃copGFP及重组骨架质粒pBHG⁃Ad5⁃
学分析，所有数据均采用均数±标准差（x ± s）表示，两 DF3⁃copGFP为模板进行PCR鉴定，片段大小分别为
组间差异分析使用t检验，多组间比较采用方差分析， 967 bp、922 bp、2 091 bp（图 1D~F），且测序结果与
实验均重复5次，P < 0.05为差异有统计学意义。 GenBank 中对应序列一致（图 1G~I），表明重组质粒

A M 1 B M 1 C M 1 G GTGGGTTTCAGGGTAGAACTGCGTGTGGAACGGGACAGGGAGCGGTTAGAGGGTGGGGCTATTCCGGGAAGTGGTG
bp bp bp

2 000 2 000 2 000
1 500 1 500 1 500 120 130 140 150 160 170 180 190
1 000 ←786 bp 1 000 ←759 bp 1 000 ←1 745 bp
750 750 750 H TGGCGCTCTTGAAGTGCATGTGGCTGTCCACCACGAAGCTGTAGTAGCCGCCGTCGCGCAGGCTGAAGGTGCGGGCG
500 500 500
D M 1 2 E M 1 2 F M 1 2
bp bp bp
430 440 450 460 470 480 490 500
2 000 2 000 2 000
1 500 1 500 1 500 ←2 091 bp I
1 000 ←967 bp 1 000 ←922 bp 1 000 TAGAGCCCTTGTACCCTACCCAGGAATGGTTGGGGAGGAGGAGGAAGAGGTAGGAGGTAGGGGAGGGGGCGGGGTT
750 750 750
500 500
500
550 570 580 590 600 610 620
PCR amplification products（A-C），PCR identification（D-F），and sequencing chromatograms（G-I）. A-C：DF3（A），copGFP（B），DF3⁃copGFP
（C）fragments；M：DNA marker，1：PCR fragments. D-F：Plasmid identification for pDC⁃DF3（D），pDF3⁃copGFP（E），pBHG⁃Ad5⁃DF3⁃copGFP（F），all
showing positive clones. M：DNA marker，1，2：PCR results of clones. G-I：Partial DNA sequencing results for pDC⁃DF3（G），pDF3⁃copGFP（H），and
pBHG⁃Ad5⁃DF3⁃copGFP（I）.
图1 PCR产物、PCR鉴定及重组质粒测序图谱
Figure 1 PCR products，PCR identification，and recombinant plasmid sequencing map

（9.2+0.8）
10
pDC⁃DF3、pDF3⁃copGFP及重组骨架质粒pBHG⁃Ad5⁃ 中病毒滴度=10 =1×10 PFU/mL。
DF3⁃copGFP构建成功。 2.4 最佳感染条件确定
2.2 穿梭质粒pDF3⁃E1A⁃P2A⁃E1B的构建 重组腺病毒（Ad⁃DF3⁃copGFP与Ad⁃hTERT⁃cop⁃
E1A⁃P2A⁃E1B经PCR扩增后，产物经凝胶电泳 GFP）分别以 MOI 为 1、3、5、10 的剂量感染 A549 细
后可见约 1 521 bp 的条带，与目的基因相符（图 胞，0~48 h 通过 HCS 分析感染情况。感染 24 h 及
2A），以重组穿梭质粒pDF3⁃E1A⁃P2A⁃E1B为模板进 MOI=3时，感染率接近90%（图4），且细胞生长状态
行PCR鉴定，可见大小约为1 671 bp的条带，电泳条 良好，24 h 后及 MOI>3 时，感染率降低且细胞状态
带大小正确（图2B），测序结果与GenBank公布的序 不佳，提示病毒量过大及感染时间过长对细胞生长
列一致（图2C），证明穿梭质粒构建成功。 产生了影响。因此选择感染 24 h 与 MOI=3 为最佳

2.3 重组病毒Ad⁃DF3⁃copGFP的包装与滴度测定 感染条件。
穿 梭 质 粒 pDF3⁃E1A⁃P2A⁃E1B 与 骨 架 质 粒 2.5 感染效率评估
pBHG⁃Ad5⁃DF3⁃copGFP 转染至 HEK293 细胞后， HCS成像结果显示A549细胞感染Ad⁃DF3⁃copGFP
HCS 成像结果显示绿色荧光拖尾（图 3），表明穿梭 及 Ad⁃hTERT⁃copGFP 后 的 感 染 率 分 别 为 80.18%
质粒中的 GFP 成功表达，初步判断病毒包装成功。 与 73.40% ，H1299 细 胞 感 染 Ad⁃DF3⁃copGFP 及
重组病毒经扩增纯化后，通过终点稀释法进行滴度 Ad⁃hTERT⁃copGFP 后的感染率分别为 79.62%与
测定，1×10 到 1×10 依次稀释度下病变阳性率总 82.08%，两种细胞感染后均稳定表达GFP白且感染
-1
-13
和 X=1×8+0.8+0.4=9.2，根据滴度计算公式，本研究 效率相近（图 5），进一步说明成功构建腺病毒且感