Page 20 - 南京医科大学自然版
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第44卷第9期
·1192 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年9月
为引物，PCR 扩增 E1A⁃P2A⁃E1B 片段（1 521 bp）， 件下培养，细胞达到 50%~60%汇合时用于转染，取
PCR产物与线性化的pDF3⁃copGFP（EcoRⅠ+HindⅢ 2 μL穿梭质粒pDF3⁃E1A⁃P2A⁃E1B、0.5 μL骨架质粒
酶切）同源重组，得到 pDF3⁃E1A⁃P2A⁃E1B，以 E1A⁃ pBHG⁃Ad5⁃DF3⁃copGFP 与 3 μL Polyplus jetPRIME
P2A⁃E1B为检测条带，MC⁃F/pDC316⁃R为引物，PCR 共转染 HEK293 细胞，转染前后 4 h 更换培养液，转
鉴定（1 671 bp）并测序验证。 染后10~15 d，当大量细胞出现病变且约一半的细
1.2.3 重组病毒Ad⁃DF3⁃copGFP的包装 胞变圆呈团状飘起时，通过低速离心收集细胞后
于六孔板中接种HEK293细胞，37 ℃、5%CO2条 DMEM 重悬，反复冻融、振荡 3 次，在 4 ℃条件下，
表1 质粒构建所需的引物
Table 1 Primers needed for plasmid construction
Primer Sequence（5′→3′）
XbaⅠ⁃DF3⁃F GCTCTAGACCTGCAGGGCCCACTAGTG
EcoRⅠ⁃DF3⁃R GAGAATTCGGTGGTGGTGAAATGGGTG
EcoRⅠ⁃copGFP⁃F GCGGAATTCGCCACCATGCCCGCCATGGAGATCGAGTGC
HindⅢ⁃copGFP⁃R GCAAGCTTAGCGAGATCCGGTGGAGC
PacⅠ⁃DF3⁃F CCTTGGATTACATCAAGATCCTCTAGTTAATTAACCTGCAGGGCCCACTAGTG
PacⅠ⁃TC⁃R GGAATAAGATCCCCGGGTACTCTAGTTAATTAAGATCCAGACATGATAAGATACATTG
MC⁃F GTACGGTGGGAGGCCTATATAAGC
SalⅠ⁃E1B⁃R GAAGTCGACGAGCTCAAGCTTTCATTCCCGAGGGTCCAGGC
pDC316⁃R CGATGCTAGACGATCCAG
VECTOR⁃R CCAGGGGGACTCTCTTGAAACCCATT
7 000 g离心5 min，收集病毒上清于-70 ℃保存。 胞中的感染效率，使用Ad⁃DF3⁃copGFP与Ad⁃hTERT⁃
1.2.4 重组腺病毒的扩增、纯化与滴度测定 copGFP重组腺病毒按MOI=3比例感染A549、H1299
将重组病毒粗提液加入到状态良好的HEK293 细胞，随后HCS拍照并初步评估感染效率。
细胞中进行二轮扩增，收集细胞后DMEM重悬，反复 1.2.7 检测Ad⁃DF3⁃copGFP非特异性感染率
冻融、振荡3 次，在4 ℃条件下7 000 g离心5 min，收 抽取健康志愿者外周血 4 mL，通过 Ficoll 密度
集病毒上清于-70 ℃保存。经二轮扩增后的病毒液 梯度离心法分离人外周血单个核细胞（peripheral
按 Adeno⁃X 病毒纯化试剂盒步骤纯化后分装入 blood mononuclear cell ，PBMC），加 入 DMEM 重
TM
库。纯化后的重组病毒感染 HEK293 细胞，通过终 悬 ，加 入 按 MOI=3 比 例 配 制 的 Ad⁃DF3⁃copGFP
点稀释法测定病毒滴度，病毒滴度计算公式：滴度= 及 Ad ⁃ hTERT ⁃ copGFP 病 毒 胶 液（含 10% FBS 的
（X+0.8） -1 -13
10 （PFU/mL），X为1×10 ~1×10 依次稀释度下 DMEM、抗人 CD45 抗体及重组病毒），后接种于
细胞病变阳性率的总和。 24 孔板中，37 ℃放置 22 h 后加 Hoechst 染色，23.5 h
1.2.5 最佳感染条件研究 时加0.3%多聚甲醛胶固定并于24 h时HCS成像，计
将A549细胞接种于96孔板中并于培养箱中培 数GFP /CD45 细胞并初步比对非特异性感染率。
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养过夜，细胞融合达到 50%时换液，设置感染复数 1.2.8 模拟CTC的检出率测定
（multiplicity of infection，MOI）梯度（1、3、5、10）并添 抽取健康志愿者外周血4 mL，A549细胞计数后
加相应体积的病毒，培养箱中培养10~16 h后换液， 分为 10、50、100、200 个，分别依次加入血液样本
继续37 ℃、5%CO2培养。选取4个感染时间点（18 h、 中来模拟 CTC，对血样进行预处理后，分别加入
24 h、40 h、48 h），高内涵细胞成像系统（high content Ad⁃DF3⁃copGFP 及 Ad⁃hTERT⁃copGFP 病毒胶液，后
screening system，HCS）拍照并分析感染情况，感染率 接种于24孔板中，37 ℃放置，按要求进行Hoechst染
80%左右，且细胞生长状态良好时对应的感染时间和 色与多聚甲醛胶固定，24 h 时 HCS 成像并计数
MOI即最佳感染条件。 CD45 /GFP 细胞（标记为肿瘤细胞），得出检出细胞
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1.2.6 检测 Ad⁃DF3⁃copGFP 对肺腺癌细胞的感染 数后通过线性回归模型分析各自的检出率。
效率 1.2.9 临床CTC检测
为了明确腺病毒（Ad⁃DF3⁃copGFP）在肺腺癌细 采用EDTA⁃K2抗凝采血管收集肺癌患者外周血
