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第41卷第10期
               ·1426 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年10月


                  树突状细胞（dendritic cell，DC）疫苗因其在肿                Healthcare 公 司 ，美 国）；CFSE（carboxyfluorescein
              瘤免疫治疗中的应用而引起广泛关注。DC 是启动                           succinimidyl ester）（BioLegend公司，美国）。
              特异性免疫应答最强大的专职抗原提呈细胞（anti⁃                         1.2  方法
              gen presenting cell，APC）。然而，DC疫苗的临床疗效             1.2.1 细胞培养及HS/PEI⁃OVA的制备
              往往由于缺乏能够引起充分免疫应答的有效抗原而                                 来源于CD11c：SV40LgT转基因C57BL/6小鼠脾
              受到限制    ［1-2］ 。因此，增强DC对抗原的加工提呈能力                  脏的mutuDC细胞株在含10%胎牛血清、100 U/mL青
              是促进DC疫苗成功应用于临床的关键策略。                              霉素、100 mg/mL 链霉素、2 mmol/L L⁃谷氨酰胺的
                  免疫佐剂常用来与抗原结合以增强其免疫原                           DMEM 培养基中培养，B3Z 细胞株（表达 LacZ 的 H⁃
              性进而诱导有效的免疫应答              ［3-4］ 。氢氧化铝是近年          2K ⁃OVA257⁃264特异性CD8 T细胞杂交瘤）在含10%胎
                                                                   b
                                                                                      +
              来应用最广泛的佐剂之一。此外，由于其卓越的安                            牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素、2
              全性，含铝佐剂已被美国食品和药物管理局批准用                            mmol/L L⁃谷氨酰胺的 RPMI⁃1640 培养基中培养。
              于临床   ［3-7］ 。然而，经典的含铝佐剂只能触发适度的                    将 0.5 mL HS（5 mg/mL）加入 1.5 mL PEI（8 000 Da，
              体液免疫应答，而无法诱导有效的细胞免疫应答。                            25 mg/mL）后与 OVA 溶液室温下共孵育 1 h 制备成
              氢氧化铝纳米颗粒由微晶纳米纤维簇组成，具有优                            HS/PEI⁃OVA混合液。
              异的蛋白质吸附性能          ［3，8］ 。许多研究表明，氢氧化铝             1.2.2 CPRG法检测DC对抗原的提呈能力
              纳米颗粒具有有效表面积大、生物相容性好、载抗原                                mutuDC 细胞（2×10 个，50 μL/孔）和刺激剂［干
                                                                                      4
                                                       ［9］
              能力强等显著优势         ［3，7-8］ 。我们之前的研究表明 ，当            扰素（interferon，IFN）⁃α、R848］作用前后的 HS/PEI⁃
              抗原共价结合到α⁃Al2O3纳米颗粒时，DC 对抗原的                       OVA（10 μg/mL，50 μL/孔）混合后放入 96 孔 U 底培
              交叉提呈效率显著提高。最近研究表明，聚乙烯亚                            养板，6 h后与B3Z细胞（2×10 个，100 μL/孔）37 ℃共孵
                                                                                         5
              胺（polyethylenimine，PEI）应用于基因传递系统时，                育过夜。离心，取上清，200 μL PBS清洗细胞后加入
              可以产生较高的表面电荷和膜干涉效应，从而促进                            CPRG工作液，37 ℃孵育4 h后加入终止液（50 μL/孔），
              有效的基因转染        ［10-11］ 。本文通过PEI修饰的氢氧化             850 g离心7 min后取上清，酶标仪595 nm波长检测
              铝纳米颗粒HS（HS/PEI）与抗原联合后负载DC以探                       吸光度。B3Z 细胞特异性识别 OVA 激活其中 LacZ
              索HS/PEI是否能增强DC对抗原的交叉提呈诱导特                         的表达，与CPRG显色底物结合后生成氯酚红，通过
              异性T细胞应答及其机制。                                      测定吸光度检测B3Z细胞的活化情况。
                                                                1.2.3 Western blot检测DC中泛素化OVA蛋白的表达
              1  材料和方法
                                                                     mutuDC（5×10 个）分别与 PEI⁃OVA、HS⁃OVA、
                                                                                 6
              1.1  材料                                           HS/PEI⁃OVA（10 μg/mL）于37 ℃共孵育6 h后以PFO
                  实验动物选用 6~8 周龄 SPF 级 C57BL/6 小鼠，               （perfringolysin O，100 ng/mL）处理 30 min，离心后收
              雌性，体重 18~20 g，购自扬州大学比较医学中心。                       集上清，蛋白定量检测试剂盒测定上清中的蛋白总
              6~8 周龄 SPF 级 OT⁃Ⅰ小鼠，雌性，体重 18~20 g，购               量。按课题组之前的方法富集PFO提取液中的泛素
                                                                      ［12］
              自南京大学模型动物研究中心。实验动物的饲养、                            化蛋白 。将带有His6标记的泛素化蛋白纯化工具
              使用和操作均获得南京中医药大学实验动物伦理                             Vx3GFP融合蛋白（30 μg/mL）加入等蛋白总量的PFO
              委员会批准。细胞株及试剂 mutuDC 细胞株和 B3Z                      提取液中，4 ℃孵育过夜。加入Ni⁃Sepharose excel层
              细胞株由美国波特兰肿瘤中心的胡红明教授馈                              析柱颗粒，4 ℃旋转混合1 h后将混合物移至层析管中
              赠。DMEM 培养基、RPMI⁃1640 培养基、胎牛血清、                    进行亲和层析纯化。离心后，用含5 mmol/L 咪唑的
              PBS（Gibco 公 司 ，美 国）；卵 清 蛋 白（ovalbumin，            Tris⁃NaCl 缓 冲 液（20 mmol/L Tris⁃Cl，300 mmol/L

              OVA）、PEI、CPRG（chlorophenol red⁃β⁃D⁃galactopy⁃     NaCl，pH 8.0）清洗树脂，最后用含 250 mmol/L 咪唑
              ranoside）（Sigma 公司，美国）；HS（Chemtrade Chemi⁃        的Tris⁃NaCl缓冲液洗脱his6⁃Vx3GFP结合的泛素化
              cals 公司，美国）；蛋白定量检测试剂盒（Thermo                      蛋白。洗脱液在 4 ℃下以 PBS 透析过夜，将富集的
              Fisher Scientific 公司，美国）；R848（Invivogen 公司，       泛素化蛋白保存在-80 ℃。通过Western blot检测其

              法国）；白介素（interleukin，IL）⁃12检测试剂盒（eBio⁃             中泛素化 OVA 蛋白的含量。将富集的泛素化蛋白
              science 公司，美国）；OVA 抗体（Santa Cruz 公司，美             经SDS⁃PAGE分离，转移到PVDF膜，加入OVA抗体
              国）；His 标签蛋白纯化填料 Ni⁃Sepharose excel（GE             4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 标记的二
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