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第41卷第12期
               ·1754 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年12月


                  鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的一种严重的人                           胞总 RNA，逆转录得到 cDNA，以 cDNA 为模板分别
              畜共患传染病，在过去数千年里造成了约 2 亿人死                          扩增 F1 抗体轻、重链可变区基因，切胶回收后连接
              亡。有记载的鼠疫大爆发约有 3 次，分别是查士丁                          于pMD⁃18t载体上，并转化入TOP10感受态细胞中，
              尼瘟疫、黑死病和第3次鼠疫大爆发，均对人类产生                           涂板培养挑取单克隆后测序，通过比对和分析，获
              了重要影响，其中第 3 次鼠疫大爆发起源于我国云                          得抗F1抗体轻、重链可变区基因序列。将抗体的可
                          ［1］
              南并持续至今 。                                          变区序列人源抗体的恒定区基因序列拼接，序列优
                  鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核                          化后全基因合成并克隆进表达质粒 pMH3 中，分别
              耶尔森菌，同属肠杆菌科耶尔森菌属。鼠疫耶尔森                            命名为pMH3⁃f1⁃k和pMH3⁃f1⁃h。
              菌有极快的繁殖速度和较强的侵袭性，感染者死亡                            1.2.2 稳定表达真核细胞系建立与筛选
              率极高，其侵袭性的强弱与杆菌表面抗原有较大关                                 取5×10 个生长良好的CHO⁃S细胞与pMH3⁃f1⁃k
                                                                           6
              系。F1蛋白是鼠疫杆菌荚膜抗原，由caf1操纵子编                         和 pMH3⁃f1⁃h两种质粒混匀后加入0.2 mm电转杯中
              码，鼠疫杆菌感染人体后，F1 抗原形成了高分子量                          进行电转染，转染后的细胞在含10%血清的DMEM/
              的聚合物，聚集在细菌表面 。F1抗原可与体内红                           F12培养基中培养，48 h后取培养液进行斑点分子杂
                                      ［2］
              细胞、淋巴细胞及组织细胞黏附，直接损伤组织，且                           交法（Dot blot）检测其表达。取100 μL上清，加入含
              随血液扩散并大量繁殖           ［3-4］ 。                      50 ng F1抗原进行ELISA检测，37 ℃孵育1 h，用PBST
                  目前F1抗原主要用于制备亚单位疫苗，同时也                         溶液清洗 3 遍，随后用辣根过氧化物酶（horseradish
              可用于鼠疫鉴定。但鼠源性抗体极易被人体免疫                             peroxidase，HRP）标记的抗人Fc段抗体孵育1 h，磷酸
              系统所排斥，同时鼠源Fc片段难以激活人体免疫系                           盐 吐 温 缓 冲 液（phosphate buffered saline tween，
              统。人源抗体的Fc片段，可以与人体内血管内皮细                           PBST）溶液清洗 5 遍后，四甲基联苯胺（tetramethyl⁃
              胞上的FcRn受体特异性结合，从而避免在体内被迅                          benzidine，TMB）显色液显色5 min，观察显色情况。
              速降解 ，鼠源性抗体因为不能与其结合，在人体内                                使用终浓度为1 000 μg/mL G418培养液培养阳
                    ［5］
              半衰期较短，限制了鼠源抗体的临床应用。兰州生                            性细胞，2周后挑取单克隆于96孔板中培养，1周后
              物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术                             做Dot blot检测，分别从6个阳性孔中挑取110个细胞
              研究中心实验室前期制备并获得了稳定表达抗鼠                             加入96孔板中培养，1周后挑取单克隆并做Dot blot
              疫F1抗体的杂交瘤细胞株4C6，并完成了抗体的保                          检测，挑选表达量最高的6株细胞进行扩增。
              护性试验 。本研究拟在前期研究的基础上，制备                                 将6株细胞稳定培养10代并冻存细胞，观察生
                      ［6］
              抗鼠疫保护性抗原F1嵌合抗体，以期在临床检验和                           长情况并取上清进行 ELISA 检测，并测定每株细胞
              鼠疫治疗中发挥作用。                                        450 nm吸光度值，挑选一株生长迅速且蛋白表达量
                                                                高的细胞进行大量培养。
              1  材料和方法
                                                                1.2.3 抗体表达与纯化
                                                                                                       7
              1.1  材料                                                对大量培养的细胞进行计数，取 3×10 个细胞
                  F1⁃4C6 杂交瘤细胞及抗 F1 抗体由兰州生物制                    加入 30 mL CHOmaxA 培养基中，在 37 ℃条件下悬
              品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究                             浮培养，每隔2 d检测细胞密度，观察细胞生长状况，
              中心实验室前期制备，TOP10感受态细胞、胶回收试                         15 d后离心收集上清。将收集的上清经0.22 μm的滤

              剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），ProteinG                       膜过滤后，使用Protein G 纯化柱纯化。浓缩后用磷
              纯化柱（GE 公司，美国），CHOMaxA 培养基（上海迈                     酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）溶液调

              邦生物有限公司），HRP标记山羊抗人IgG二抗、Mil⁃                      整其浓度为 1 mg/mL。取 20 μL 抗体加入带有还原
              lipore 超滤离心管（10 000 kDa）（Sigma公司，美国），             剂的加样缓冲液，于 100 ℃水浴锅中水浴 5 min，随
              限制性内切酶 NotⅠ和 EcoRⅠ（NEB 公司，美国），                    后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodi⁃
              TMB 显色液及终止液（上海碧云天），ProteinG 琼脂                    um dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，
              糖珠、总RNA提取试剂盒（Thermo公司，美国）。                        SDS⁃PAGE），并进行考马斯亮蓝染色。

              1.2  方法                                           1.2.4 抗体特性分析
              1.2.1 人源化质粒构建                                     1.2.4.1 间接ELISA检测
                  将生长良好的 F1⁃4C6 细胞消化裂解后提取细                           每孔 50 ng F1 抗原包被酶标板，将纯化抗体从
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