Page 49 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 49
第41卷第12期 匡 衡,蔡 欣,杨 展,等. 抗鼠疫抗原F1的嵌合抗体制备及特性分析[J].
2021年12月 南京医科大学学报(自然科学版),2021,41(12):1753-1758 ·1755 ·
1∶200 开始梯度倍比稀释后加入酶标板,37 ℃孵育 M 1 2
bp
1 h 后洗涤 3 遍,加入 HRP 标记二抗,继续于 37 ℃
2 000
孵育 1 h 后洗涤 3 遍,用 TMB 显色液显色,测定
D(450 nm)值。 1 000
1.2.4.2 竞争性ELISA检测 750
50 ng/孔F1抗原包被酶标板,以1∶2 000浓度加 500
入抗F1抗体孵育1 h,洗涤后,将纯化后的人源化F1 ←353 bp
←322 bp
嵌合抗体从1∶50开始倍比稀释,加入酶标板孵育1 h, 250
PBST 洗涤 5 遍,加入 HRP 标记的抗人 Fc 段抗体孵
育后显色,测定D(450 nm)值。
1.2.4.3 亲和力检测 1:重链;2:轻链;M:DL2000marker。
图1 PCR获得轻重链条带
使用Biacore X100分析仪进行亲和力检测。选
Figure 1 Light and heavy chain obtained by PCR
取CM5芯片,并在芯片上固定F1抗体,将抗F1的嵌
合抗体和抗 F1 鼠源抗体梯度稀释后进样分析。使 M 1 2
bp
用Biacore X100软件分别计算其亲和力。
1.2.4.4 免疫沉淀 2 000
将抗F1抗原嵌合抗体与含有裂解液的F1抗原 ←1 598 bp
混合,于4 ℃下摇床孵育过夜,加入Protein G琼脂糖 1 000
←907 bp
于 4 ℃下摇晃过夜。离心后取沉淀进行 SDS⁃PAGE
凝胶电泳,考马斯染色后切割条带做质谱分析。 500
2 结 果 250
2.1 抗F1抗体轻链、重链真核表达载体的构建
1:轻链质粒;2:重链质粒;M:DL10000marker。
PCR获得4C6杂交瘤细胞中抗F1轻、重链可变
图2 轻重链质粒双酶切条带
区基因,琼脂糖凝胶电泳检测条带大小符合预期, Figure 2 Light and heavy chain plasmid by double en⁃
轻链为300 bp左右,重链为350 bp左右(图1),分别 zyme digestion
将轻、重链可变区基因片段克隆到 pMD⁃18T 载体
中,并转化至Top10感受态细胞,培养并挑取单克隆
测序。分别将抗F1抗体轻链、重链可变区基因与人
源抗体恒定区基因拼接后,全基因合成并克隆进
pMH3 质粒中,质粒双酶切结果显示轻链条带为
1 2
700 bp左右,重链条带为1 400 bp左右,与设计条带
大小相符(图2)。 1:转染细胞培养液;2:对照组培养液。
图3 转染后培养液Dot blot检测
2.2 稳定表达细胞系建立与筛选
Figure 3 Dot blot detection of culture medium after trans⁃
使用电穿孔技术,将轻、重链表达质粒共转入 fection
CHO⁃S 细胞中,转染 48 h 后,取上清进行 Dot blot 与
ELISA 检测。结果表明,转染后的细胞可以表达抗 2.3 抗体表达与纯化
F1 嵌合抗体 IgG,并与酶标板包被的 F1 抗原结合 将3×10 个细胞悬浮培养于30 mL CHOmaxA培
7
(图3)。 养基中,每2 d测定细胞密度。细胞培养15 d后,离
使用G418筛选2周,将细胞挑取2次单克隆,取 心并收集上清进行Dot blot与ELISA检测均为阳性,
上清做Dot blot 检测,挑选目的蛋白表达量最高的6 结果提示,CHMIgG⁃F14C6⁃5 细胞可以于悬浮培养
株单克隆细胞,稳定传代培养 10 代,取上清进行 基中稳定表达抗F1嵌合抗体。
ELISA 检测,挑选表达蛋白量最高的一株命名为 上清经ProteinG 亲和纯化后,得到抗F1嵌合抗
CHMIgG⁃F1C6⁃5,扩大培养进行下一步实验(图4)。 体,加入 PBS 溶液调整浓度为 1 mg/mL。经 SDS⁃