Page 28 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第4期
·498 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年4月

green 配制反应体系，在 PCR 扩增仪上对目的基因 1.3 统计学方法
-ΔΔCt 计算 采用 SPSS25.0 进行统计分析。实验结果以均
NTN1 和内参基因 GAPDH 进行扩增。以 2
实验组目的基因相对于对照组目的基因的表达倍 数±标准差（x ± s）表示，组间数据比较采用单因素方
数。实验重复 3 次，取均值。引物序列见表 1。 差分析，LSD⁃t 检验进行两两比较，以 P < 0.05 为差
异有统计学意义。
表1 引物及小干扰RNA设计
Table 1 Sequences of PCR Primers and siRNA 2 结 果
名称 序列5′→3′
2.1 PCB1254暴露对RGC⁃5细胞中NTN1表达水平和
NTN1引物 上游：CCCAAAATCAAGCCCCTCAA
ERK通路的影响
下游：TGTCTGCCACGATGCCACTC
RT⁃qPCR 结果显示，与溶剂对照组（meth组）相
β⁃actin引物 上游：GAGAGGGAAATCGTGCGT
比，PCB1254暴露后 NTN1 mRNA 表达降低（P < 0.05，
下游：GGAGGAAGAGGATGCGG
图 1A）；Western blot 结果显示，与溶剂对照组（meth
si⁃NTN1 上游：GCAUCCCGGACUUUGUCAATT
组）相比，NTN1 及 p⁃ERK 的蛋白表达量均降低，当
下游：UUGACAAAGUCCGGAUGCTT
PCB1254暴露浓度为2.5 mg/L时，NTN1及p⁃ERK水平
si⁃NC 上游：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
下游：ACGUGACACGUUCGGAGAATT 较对照组降低显著，但总 ERK 表达量基本不变，差
异有统计学意义，在 5 mg/L 组中差异更明显（图

1.2.6 Western blot 检测 NTN1 及 ERK 信号通路相 1B）。提示PCBs暴露可能通过降低NTN1的表达从
关蛋白的表达 而抑制ERK信号分子的磷酸化。
在染毒或转染RGC⁃5细胞48 h后，收集细胞提 2.2 沉默 NTN1 对 RGC⁃5 细胞功能及 ERK 信号通
取总蛋白检测 NTN1、p⁃ERK 和 ERK 的蛋白表达。 路的影响
将等量的样品在 10％SDS⁃PAGE 凝胶上进行电泳， 采用 NTN1 小干扰 RNA 转染细胞，RT⁃qPCR 及
120 V 恒压电泳，300 mA 恒流转膜 90 min，室温 5% Western blot 方法检测转染效率，结果显示，沉默组
脱脂奶粉溶液封闭 2 h，4 ℃孵育一抗过夜，TBST 洗 NTN1 mRNA和蛋白表达与对照组（si⁃NC组）比较均
膜后二抗常温孵育90 min，最后使用ECL发光液，暗 明显下降，提示转染成功，差异有统计学意义（图
室胶片曝光。实验均重复3次，取平均值。 2A、B）。细胞周期检测结果显示，沉默组 S 期细胞

A 1.5
mRNA相对表达量 1.0 * * *

NTN1 0.5
0.0
blank meth 0.6251.250 2.500 5.000
PCB1254 （mg/L）
B PCB1254 （mg/L） 1.5 1.5
blank meth 0.6251.250 2.500 5.000
NTN1/GAPDH 蛋白相对表达水平 *** p⁃ERK/ERK 蛋白相对表达水平 ***
NTN1 75 kDa 1.0 ** 1.0

p⁃ERK 44 kDa 0.5 *** 0.5
42 kDa ***
44 kDa
ERK
42 kDa
0.0 0.0
blank meth 0.6251.250 2.500 5.000 blank meth 0.6251.250 2.500 5.000
GAPDH 36 kDa
PCB1254 （mg/L） PCB1254 （mg/L）
A：不同浓度PCB1254暴露后各组细胞内NTN1的mRNA表达水平（n=9）；B：不同浓度PCB1254暴露后各组细胞内NTN1及ERK信号通路分子
（ERK信号分子磷酸化水平）的蛋白表达水平（n=3）。与溶剂对照组（meth组）比较，P < 0.05，P < 0.01， P < 0.001。
**
***
*
图1 PCB1254暴露后对RGC⁃5细胞中NTN1的表达水平和ERK通路的影响
Figure 1 Effects of PCB1254 exposure on NTN1 expression level and ERK pathway in RGC⁃5 cells