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第41卷第4期 张舒纯，张        昕，李景云，等. NTN1调控ERK信号通路拮抗PCBs暴露致视网膜神经节细胞发育异常［J］.
                  2021年4月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：496-502                       ·497 ·


                effects of PCB 1254 on retinal development.
               ［Key words］ NTN1；RGC⁃5；PCB1254；ERK signaling pathway；cell proliferation
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2021，41（04）：496⁃502］







                    多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs），作        糖培养液培养大鼠 RGC⁃5 细胞，置于 37 ℃、含 5%
                为一种常见的环境污染物，会对儿童的视觉发育造成                           CO2 细胞培养箱中，待细胞长至 80%融合时传代。
                影响。研究表明，误食PCBs污染的食物会导致子代                          调整细胞密度为5×10 个/L接种至6孔板内，待细胞
                                                                                      6
                出现眶周水肿、视力下降、视功能减低等表现                   ［1-2］ 。前   长至70%融合时进行染毒或转染。
                期实验表明，PCBs暴露可导致子代斑马鱼畸形率和                          1.2.2 PCB1254染毒液配制及染毒
                死亡率明显升高，子代斑马鱼视网膜形态异常，导致                               PCB1254以甲醇为助溶剂配制成浓度为1.0 g/L的
                其视动反应敏感性降低，抑制视网膜神经节细胞的                            储备液备用，4 ℃冰箱储存。前期研究得出 PCB1254
                增殖并促进其凋亡         ［3- 4］ ，PCB1254 可以通过抑制 miR⁃      对RGC⁃5细胞半数致死量（LC50 ）为3.409 mg/L（数据
                182 的表达来影响 RGC⁃5 细胞的增殖和凋亡 。然                      未发表），使用 DMEM 完全培养基将 1.0 g/L 的储备
                                                        ［5］
                而，PCBs暴露导致视网膜尤其是神经节细胞发育异                          液稀释成4个工作浓度，分别是0.625、1.250、2.500和

                常的具体机制尚不明确。轴突导向因子⁃1（netrin⁃                       5.000 mg/L，并设立空白对照组及0.01%甲醇对照组。
                1，NTN1）作为一种神经轴突导向因子，在胚胎发育                         1.2.3 小干扰RNA转染细胞及慢病毒感染细胞
                中发挥重要的调控作用。NTN1可通过介导视神经                               调整细胞浓度为5×10 个/L接种至 6孔板内，待
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                乳头，与视神经发育密切相关，其缺失会造成视神                            细胞长至 70%融合时使用 NTN1 小干扰 RNA 借助
                经乳头发育不良，细胞减少，视杯发育不全                   ［6-7］ 。因    Lip3000进行转染，小干扰RNA序列见表1。用于过
                此，本研究以视网膜神经节细胞 RGC⁃5 为研究对                         表达的慢病毒构建体和阴性对照载体，按制造商的
                象，探讨 NTN1在PCBs暴露致子代视网膜神经节细                        说明进行细胞感染。融合度为40％时，RGC⁃5细胞
                胞发育异常中的作用机制，从而为环境污染物暴露                            感染了阴性对照慢病毒（lv⁃NC，1×10 TU/mL）或
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                致子代视网膜发育异常的防治提供理论依据。                              NTN1 慢病毒（lv⁃NTN1，1 ×10 TU/mL）并与 5 μg/mL
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                1  材料和方法
                                                                  基中，并用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株。
                1.1  材料                                           1.2.4 RGC⁃5细胞功能检测
                    视网膜神经节细胞株RGC⁃5购自美国ATCC细                           细胞计数后接种于 96 孔板，每孔 4 000 个细
                胞库。DMEM 高糖培养基、胎牛血清（fetal bovine                   胞，贴壁培养 12 h 后按不同实验目的处理。每组设
                serum，FBS）、青链霉素、0.25%胰酶（Thermo公司，美                5个平行孔，设对照孔和空白孔，每孔加入CCK⁃8试
                国）；PCB1254、Lip3000、聚凝胺（polybrene）（Sigma 公         剂10 μL，孵育2 h 后，在酶标仪上测定450 nm 处的
                司，美国）；ERK、p⁃ERK抗体和山羊抗兔辣根过氧化                       吸光度。细胞活力=（实验组吸光度值-空白吸光度
                物酶标抗体（CST公司，美国）、GAPDH抗体（武汉三                       值）/（对照组吸光度值-空白吸光度值）×100%，计算
                鹰生物技术有限公司）、β⁃actin和NTN1抗体（Ａbcam                   出各组细胞活力百分比来反映细胞的增殖能力。
                公司，美国）；CCK⁃8试剂盒（同仁公司，日本）；细胞周                      使用细胞 DNA 含量检测试剂盒及流式细胞仪检测
                期检测试剂盒（苏州宇恒生物科技有限公司）；总                            细胞周期。使用凋亡双染试剂盒和流式细胞仪检

                RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；cD⁃                        测细胞凋亡。
                NA反转录试剂盒（Thermo公司，美国）；NTN1过表达                     1.2.5 RT⁃qPCR检测NTN1的mRNA表达
                慢病毒及小干扰 RNA（上海吉玛制药技术有限公                               在染毒或转染 48 h 后用 TRIzol 裂解细胞，按试
                司）；NTN1扩增引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。                        剂盒提取步骤，提取和纯化总 RNA 并测定浓度。

                1.2  方法                                           利用反转录试剂盒配制反应体系将样品反转录为
                1.2.1 细胞培养                                        cDNA，反应条件为 25 ℃ 5 min，42℃ 60 min，70 ℃
                    配制含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM高                       5 min，4 ℃ 10 min。根据试剂盒说明，使用 SYBR
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