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第41卷第5期 彭明玉，何庆玲，王文博，等. 大鼠S100A8基因启动子质粒的构建及其SOX7结合元件的初步鉴定［J］.
2021年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（05）：637-642 ·639 ·
荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega 公司，美 截短质粒。后由该公司将S100A8基因启动子-86~
国）；基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化技术有 -57 nt 区 SOX7 结合元件 5′⁃GAAATGCTCAATGT⁃
限）；SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒（上海生工 GCTCAGTGATTGCCAC⁃3′突变为 5′⁃GGGCGCGC⁃
生物工程股份有限公司）；高保真酶 PrimeSTAR@ GCGCTATAGGGCGCGCGCGCCC⁃3′，突变质粒命名
Max DNA Polymerase、限制性内切酶 KpnⅠ、SmaⅠ 为pGL3⁃S100A8⁃M。
和T4 DNA连接酶（TaKaRa公司，日本）。 1.2.5 重组质粒转染HEK⁃293T细胞
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1.2 方法 将HEK⁃293T细胞接种于24孔板中（1×10 个/孔），
1.2.1 引物设计 培 养 24 h 后 ，用 Lipofectamine 2000 将 pIRES2 ⁃
登 录 NCBI，通 过 Gene 数 据 库 中 搜 索 大 鼠 SOX7、pRL⁃SV40分别与S100A8基因启动子全长质
S100A8 基因（ID：116547），利用 Primer 5.0 软件辅助 粒及各截短质粒转染HEK⁃293T细胞。
设计针对 S100A8基因启动子区（-2 068~+174 nt）的 1.2.6 荧光素酶活性的测定
引 物 ，上 游 ：5′ ⁃ GGGGTACCATCCTAGCAGATGT⁃ 待上述质粒共转染 HEK⁃293T 细胞 48 h 后，用
GAGATGG ⁃ 3′ ；下 游 ：5′ ⁃ TCCCCCGGGGCTACTC⁃ 双荧光素酶报告基因检测试剂盒中 PLB 裂解液稀
TATTCCCCCAACTC⁃3′，并在上下游引物序列前加入 释 后 裂 解 细 胞 ，收 集 细 胞 裂 解 产 物 ，分 别 检 测
KpnⅠ、SmaⅠ酶切位点序列，后交由滁州通用生物系 S100A8 基 因 启 动 子 质 粒 及 内 参 照 质 粒（pRL ⁃
统有限公司制备。 SV40）的荧光活性，其中，目的基因的萤火虫荧光
1.2.2 大鼠S100A8基因启动子全长序列的扩增 素酶活性（M1）/ pRL⁃SV40 质粒的海肾荧光素酶活
以大鼠基因组 DNA 为模板，用 PrimeSTAR@ 性（M2），即为被检测质粒的相对荧光素酶活性
Max DNA Polymerase 进 行 PCR 反 应 ，反 应 体 系 ： （RLU）。
PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，上、下游引物各 1.3 统计学方法
2 μL，基因组 DNA 2 μL，灭菌双蒸水 19 μL；反应程 所得定量数据均以均数±标准误（x ± sx ）表示。
序：98 ℃变性10 s；60 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸2 min， 采用 SPSS 19.0 软件对所得数据进行方差分析和
循环 30 次；扩增产物经 SanPrep 柱式 PCR 产物纯化 Bonfferoni法两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
试剂盒回收。
2 结 果
1.2.3 大鼠 S100A8 基因启动子全长荧光素酶报告
质粒的构建与鉴定 2.1 大鼠S100A8启动子荧光素酶报告质粒的构建
将 pGL3⁃basic 质粒与 S100A8 基因启动子 PCR 与鉴定
产物与限制性内切酶KpnⅠ和SmaⅠ 37 ℃水浴2 h， PCR 扩增大鼠 S100A8 全长启动子（-2 068~
利用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒分别回收线 +174 nt）后，经双酶切插入 pGL3⁃basic 质粒中，将重
性化的pGL3⁃basic质粒和S100A8启动子PCR产物， 组质粒转化后均匀涂布于含Amp抗性的固体LB平
再通过T4 DNA连接酶进行连接反应（16 ℃，8~12 h）， 板琼脂表面，经菌液 PCR 筛选出阳性克隆菌落，再
并将连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5α，将其均 送公司测序验证，测序结果显示质粒构建成功，命
匀涂布于含 Amp 抗性的 LB 平板琼脂表面，于 37 ℃ 名为pGL3⁃S100A8⁃FL（图1）。
中培养 12 h 后，挑取 5 个单克隆菌落于 3 mL 含有 2.2 过表达 SOX7 对大鼠 S100A8 启动子全长活性
Amp 抗性的液体 LB 培养基中，37 ℃震荡培养 12 h。 的影响
取 1 μL 培养后的菌液作为模板 DNA 进行 PCR 鉴 将 pIRES2⁃EGFP、pIRES2⁃SOX7、pRL⁃SV40 和
定，筛选出的阳性克隆送通用生物系统（安徽）有限 pGL3⁃S100A8⁃FL 不同分组共转染 HEK⁃293T 细胞，
公司测序鉴定，将构建成功的质粒命名为 pGL3⁃ 转染后 48 h 检查 GFP 表达情况，发现 GFP 显著表
S100A8⁃FL。 达，其转染效率约为 80%（图 2）。随后裂解细胞并
1.2.4 大鼠 S100A8 基因启动子截短和突变质粒的 进行荧光素酶报告基因检测，结果显示，pGL3⁃
构建与鉴定 S100A8⁃FL、pIRES2⁃SOX7 与 pRL⁃SV40 共转染组其
利用 JASPAR 软件预测 S100A8 基因启动子区 RLU值显著高于pGL3⁃S100A8⁃FL、pIRES2⁃EGFP与
SOX7 的结合元件，并根据预测结果通过通用生物 pRL⁃SV40 共转染组，提示 SOX7 过表达能够明显上
系统（安徽）有限公司构建 4 个 S100A8 基因启动子 调S100A8基因的启动子活性。
