Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第5期
·640 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年5月

M FL A
2 000 bp —2 242 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp

250 bp
B
4 *
100 bp
3
M：marker；FL：pGL3⁃S100A8⁃FL菌液PCR扩增产物。
图1 琼脂糖凝胶电泳结果 RLU值 2
Figure 1 Agarose gel electrophoresis results 1
0
2.3 SOX7 过表达对大鼠 S100A8 基因启动子活性 pIRES2⁃ECFP pIRES2⁃SOX7
的影响 pGL3⁃S100A8+pRL⁃SV40
2.3.1 大鼠 S100A8 基因启动子各截短质粒位置的 A：pGL3⁃S100A8⁃FL、pRL⁃SV40 和 pIRES2⁃SOX7 质粒共转染
确定 HEK⁃293T 细胞后 48 h，GFP 的表达情况（左：白光；右：荧光；×40）；
B：HEK⁃293T 细胞中转染不同质粒后 S100A8 基因启动子荧光素酶
应用生物信息学软件 JASPAR 对 S100A8 基因
活性（两组比较，P < 0.01，n=3）。
*
启动子全长序列中 SOX7 的结合元件进行预测（表 图2 HEK⁃293T细胞中质粒共转效率的评估以及SOX7过
1）。参考其各结合元件的位置，设计相应的截短质 表达对大鼠S100A8基因启动子全长荧光素酶活性的
粒（表2）。 影响
2.3.2 大鼠 S100A8 基因启动子各截短质粒的构建 Figure 2 Transfection efficiency of plasmids in HEK ⁃
与鉴定 293T cells and the effect of SOX7 overexpres⁃
基于 pGL3⁃S100A8⁃FL 质粒，由通用生物系统 sion on rat S100A8 gene full ⁃ length promoter
activity
（安徽）有限公司构建上述 4 个截短质粒，即 pGL3⁃
表 1 JASPAR 预测的大鼠 S100A8 基因启动子区 SOX7 结
S100A8⁃1、pGL3⁃S100A8⁃2、pGL3⁃S100A8⁃3和pGL3⁃
S100A8⁃4，测序结果显示 pGL3⁃S100A8⁃1~4 截短质 合元件
Table 1 SOX7 binding elements within rat S100A8 gene
粒构建正确。 promoter predicted by JASPAR
2.3.3 SOX7过表达对大鼠S100A8基因启动子各截
预测的SOX7结合元件 位置
短质粒活性的影响
1号元件 -1 979~-1 957nt
将 pGL3 ⁃ basic、pGL3 ⁃ S100A8 ⁃ FL 和 pGL3 ⁃ 2号元件 -918~-896nt
S100A8 各截短质粒分别与 pIRES2⁃SOX7 和 pRL⁃ 3号元件 -735~-713nt
SV40共转染HEK⁃293T细胞，转染后48 h裂解细胞并 4号元件 -595~-573nt
测定其荧光素酶活性，转染 pGL3⁃S100A8⁃4 细胞的 5号元件 -86~-57nt
RLU 值较 pGL3⁃S100A8⁃FL 和 pGL3⁃S100A8⁃1~3 转 表2 S100A8截短质粒位置
染组相比显著降低（图3）。提示S100A8基因启动子 Table 2 location of different S100A8 truncated luciferase
区的SOX7结合元件可能位于-200~+51 nt区域。 reporter plasmids

2.3.4 SOX7过表达对大鼠S100A8基因启动子突变 名称 位置
质粒活性的影响 1号截短 -1 802~+174 nt
2号截短 -756~+174 nt
为了进一步确定SOX7在S100A8启动子-200~
+51 nt区内的结合元件，根据JASPAR结合元件预测 3号截短 -200~+174 nt
4号截短 +51~+174 nt
结果，又开展了启动子突变实验，构建了 S100A8 启
动子-86~-57 nt 区突变的荧光素酶报告质粒，即将 突变为 5′⁃GGGCGCGCGCGCTATAGGGCGCGCGC⁃
5′ ⁃ GAAATGCTCAATGTGCTCAGTGATTGCCAC ⁃ 3′ GCCC⁃3′，并将其命名为 pGL3⁃S100A8⁃FL⁃M。将