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第41卷第5期 严婕妮，许馨予，李 欣，等. 滤泡细胞毒性T细胞在非肥胖糖尿病小鼠免疫损伤进程中的作用研究［J］.
                  2021年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（05）：643-651                       ·645 ·


                EDTA（上海凌峰化学试剂有限公司），胎牛血清                           细胞染色，加入 1.25 μL 抗鼠 CD3⁃APC/Cy7 抗体、
               （Gibco 公司，美国），RPMI 1640 培养基、青霉素⁃链                  1.25 μL 抗 鼠 CD8a ⁃ PerCP/Cy5.5 抗 体 ，1 μL 抗 鼠
                霉素双抗（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。              CD185（CXCR5）⁃PE 抗体、0.5 μL 抗鼠/人 CD44⁃Al⁃
                    FACS Calibur 流式细胞仪、FACS Aria 流式细胞             exa Fluor 700 抗体，震荡混匀，再分别加入抗鼠
                仪、流式专用试管（BD 公司，美国），血糖仪、血糖试                        CD279（PD⁃1）⁃APC抗体、抗鼠CD107a⁃APC抗体、抗
                纸（TERUMO公司，日本），15 mL离心管、50 mL离心                   鼠 KLRG1⁃APC 抗体、抗鼠 TIM3⁃APC 抗体各 1 μL，
                管（Corning公司，美国），细胞培养箱、落地高速离心                      震荡混匀。4 ℃避光静置15 min。加3 mL PBS重悬
                机（Thermo Fisher Scientific公司，美国），生物安全柜            细胞，4 ℃、1 500 r/min 离心 5 min。弃上清，并加入

               （苏州安泰空气技术有限公司），涡振荡器 IKA Vor⁃                       200 μL PBS 重悬细胞。最后将样品置于流式细胞
                tex Genius 3（IKA公司，德国）、移液器（1 mL/200 μL/           仪中上机检测。
                50 μL/10 μL/2.5 μL）（Dragonmed公司，芬兰）。              1.2.4 细胞胞内因子流式抗体标记染色

                1.2  方法                                               配制刺激剂：1640 完全培养基+75 ng/mL 佛波
                1.2.1 动物分组                                        酯（phorbol myristate acetate，PMA）+1 μg/mL 离子霉

                    选取4、10、15、20、25周龄及高血糖（hyperglyce⁃             素（Ionomycin）+ 10 μg/mL 布雷非德菌素 A（Brefeld⁃
                mia，Hi）组NOD小鼠经过标准饲料喂养10周后，每周                      in A，BFA）。取分离好的脾脏、淋巴结、胸腺组织的
                测量血糖，2次重复血糖值>16.7 mmol/L被认为是显                     细胞 2×10 个分别置于流式管中，每管加入 1 mL 提
                                                                           6
                性糖尿病（即高血糖组），随机分成6组，每组6~10只。                       前配制好的刺激剂，置于 5% CO2 的 37 ℃恒温恒湿
                1.2.2 脾脏、淋巴结和胸腺组织分离                               培养箱中刺激 5~6 h。刺激结束后，加入 3 mL Add⁃
                    提前准备好培养皿，皿内铺置一张 200 目尼龙                       ing Buffer，4 ℃、1 500 r/min 离心 5 min。弃上清，避
                滤膜并提前加入 5 mL 缓冲液（Adding Buffer）（99%               光条件下加入 1.25 μL 抗鼠 CD8a⁃PerCP/Cy5.5 抗
                PBS 缓冲液加上 1%胎牛血清），将皿放置于冰盒                         体。震荡混匀。4 ℃避光静置15 min。加3 mL Add⁃
                内。将每组 NOD 小鼠摘除眼球放血，颈部脱臼处                          ing Buffer重悬细胞，4 ℃、1 500 r/min离心5 min。弃
                死，并置于 75%乙醇中浸泡数分钟，之后将 NOD 小                       上清，加入100 μL破膜剂A，重悬后，室温避光静置
                鼠固定于解剖操作台上（提前将固定针、眼科剪、镊                           15 min 。 加 3 mL Adding Buffer 重 悬 细 胞 ，4 ℃ 、
                子浸泡于 75%乙醇中数分钟），无菌分离摘取小鼠                          1 500 r/min 离心 5 min。弃上清，加入 100 μL 破膜
                脾脏、淋巴结（腹股沟、腋下、肠系膜、腹主动脉旁处                          剂 B，3 μL 抗人/鼠 Granzyme B⁃FITC 抗体、0.5 μL 抗
                引流淋巴结）、胸腺。将取出的器官组织放入提前                            鼠 IFN⁃γ⁃Brilliant Violet 421 抗体。震荡混匀。4 ℃
                准备好的培养皿中。                                         避光静置 30 min。加入 3 mL Adding Buffer 重悬细
                    在脾脏、淋巴结、胸腺上分别覆盖一层 200 目                       胞，1 500 r/min，温度 4 ℃的条件离心 5 min，弃去上
                滤膜，用 5 mL 无菌注射器末端研磨，将研磨液吸入                        清，并加入200 μL Adding Buffer 重悬细胞。最后将
                15 mL 离心管中，再用 5 mL Adding Buffer 液冲洗滤             样品置于流式细胞仪中上机检测。
                膜，同时将冲洗液也移入离心管中。将离心管置于离                           1.3  统计学方法
                心机水平转子中，经4 ℃、1 500 r/min离心5 min，弃上                    应用FlowJo vX.0.7流式分析软件分析流式结果；
                清，重悬细胞。将重悬后的细胞加入Adding Buffer定                    使用GraphPad Prism 7.0做图软件进行图形处理。涉
                容至1 mL细胞悬液，加入10 mL红细胞裂解液（1×），                     及的统计学方法包括t检验、单因素方差分析（组间比
                将离心管于冰上静置 5 min 后，4 ℃、1 500 r/min 离               较前均进行正态性检验和方差齐性检验，不满足正态

                心 5 min。弃上清，重悬细胞并加入 10 mL Adding                  分布或方差齐性则使用非参数检验方法）、多重假设
                Buffer 洗涤细胞 1 次。弃上清，用 1mL Adding Buffer           检验。多组间比较使用Kruskal⁃Wallis 检验。实验均
                重悬细胞并经200目尼龙滤膜将细胞悬液过滤（以除                          独立重复3次，P < 0.05为差异有统计学意义。
                去细胞碎片）至另一15 mL离心管中。经显微镜下细
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                胞计数并取2×10 个细胞，用于流式抗体标记及检测。
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                1.2.3 细胞表面流式抗体标记染色                                2.1  TFC在NOD小鼠脾脏、淋巴结细胞比例远高于
                    取分离好的脾脏、淋巴结、胸腺组织的细胞 2×                        胸腺
                10 个分别置于流式管中，取适量流式荧光抗体进行                              为了观察 TFC 在 NOD 小鼠中不同免疫器官间
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