Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第6期
               ·812 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年6月


              孔4 000个细胞，用均添加了1%胎牛血清的hAMSC                       2000 分光光度法测量 RNA 的质量和浓度。用逆转
              ⁃CM 或对照培养基，在 37 ℃含 5% CO2的细胞培养                    录试剂盒将1 μg 总RNA 逆转录为cDNA，使用Hieff
              箱中培养 4~6 h。实验独立重复 3 次，在 100 倍的光                   qPCR SYBR Green Master Mix 和 PCR 检测系统进行
              学显微镜下获取成管图像，然后在每孔中随机选取                            实时荧光定量 PCR（quantitative real⁃time PCR，qRT⁃
              3个视野，使用Image J软件定量分析总成管长度。                        PCR）实验。分别用 GAPDH 和 U6 作为检测 circ⁃
              1.2.4 瘢痕愈合实验和Transwell穿梭实验                        RNA 和 miRNA 的内参。用循环相对表达量计算阈
                  待 HUVEC 在含有 10%胎牛血清的 DMEM 培养                  值（Ct值）和2    -ΔΔCt 来表示目的基因相对表达量。
              基中（6 孔板中每孔 1×10 个细胞）长满形成单层后                       1.2.8 分组处理
                                     4
              用移液管尖端刮出一条直线形成一个间隙，用 1×                                CM 组：培养体系为 hAMSC⁃CM（80% CM）培养
              PBS 洗涤去除细胞碎片。换成含 2%胎牛血清的                          基；CM+si⁃NC 组：先在 DMEM 完全培养基条件下转
              hAMSC⁃CM（80% CM）或含2%胎牛血清的对照培养                     染对照 siRNA，再换成 hAMSC⁃CM（80% CM）培养
              基培养 13 h。在 0 h 和 13 h 使用光学显微镜观察细                  基；CM+si⁃circ⁃0001649 组：先在 DMEM 完全培养基
              胞迁移状态并获得显微图像（标记位置每孔 3 张）。                         条件下转染 siRNA 敲低 circ⁃0001649，再换成 hAM⁃
              对于每一幅图像，使用 Image J 软件测量缝隙的面                       SC⁃CM（80% CM）培养基。使用 miR⁃203a 的类似物
              积。实验独立重复3次，对于每一组，测量每个间隔                           miR⁃203a mimic 和抑制剂 miR⁃203a⁃inhibitor 处理
              内的3个随机位置。细胞的迁移率计算为［（0 h的缝                         HUVEL细胞，分为：mimic⁃NC组、mimic组、inhibitor⁃
              隙面积-13 h的缝隙面积）/0 h的缝隙面积］，最终用各                     NC 组、inhibitor 组：在 DMEM 完全培养基培养下进
              组与阴性对照组的比值显示，以对照组为标准化1。                           行相应的转染；si⁃NC+inh⁃NC 组、si⁃circ⁃0001649+
                  Transwell 穿梭实验：准备8.0 μm的Transwell 小           inh⁃NC 组、si⁃circ⁃0001649+inh 组、si⁃NC+inh 组：在
              室和对数生长期的 HUVEC。在下室中预先加入                           DMEM 完全培养基培养下进行相应的共转染后换
              600 mL 含 5%胎牛血清的 hAMSC⁃CM（80% CM）或                成hAMSC⁃CM（80% CM）培养基。
              含 5%胎牛血清的对照培养基，上室加入 200 mL 无                      1.3  统计学方法
              血清对照培养基（8 000个细胞）。小室放置在37 ℃                            采用 SPSS15.0 进行统计分析。定量数据显示
              培养箱孵育12 h后，将附着在小室下表面的迁移细                          为平均值±标准差（x ± s）。两组数据比较采用 t 检
              胞在室温下用含 10%甲醇的 0.1%结晶紫固定染色                        验。多组数据比较采用 ANOVA⁃SNK 检验。所有
              1 h。实验独立重复3次，光学显微镜下观察并随机                          的统计检验都是双尾检验，P < 0.05 为差异有统计
              对3个视野的细胞进行计数和拍照。细胞的迁移率                            学意义。
              最终用各组与阴性对照组穿出细胞的比值显示，以
                                                                2  结 果
              对照组为标准化1。
              1.2.5 细胞转染                                        2.1  hAMSCs⁃CM 通过促进 circ⁃0001649 表达诱导
                  针对circ⁃0001649的特异性小干扰RNA（siRNA）               HUVEC的成管和迁移
              和 miR⁃203a 抑制剂购于广州锐博公司。siRNA                           与对照组相比，HUVEC与hAMSC⁃CM共同孵育
             （50 nmol/L）或抑制剂（100 nmol/L）用Lipofectamine     ®    24 h 后，细胞内 circ⁃0001649 的表达水平明显升高
              2000转染试剂按照说明书步骤进行转染。                              （图 1A），提示 circ⁃0001649 可能参与了 hAMSC⁃CM
              1.2.6 蛋白印迹实验                                      的促血管生成过程。为了验证这一猜想，转染siRNA
                  收集细胞进行裂解、离心收集总蛋白。使用                           来 敲 低 HUVEC 中 circ ⁃ 0001649 的 表 达（图 1B）。

              10% SDS⁃PAGE 电泳分离蛋白，并电转移至 PVDF                    hAMSC⁃CM刺激组与对照组相比，HUVEC的成管能
              膜。在室温下用 5%脱脂牛奶封闭 1 h 后分别加入                        力和迁移能力均提高。然而当在 HUVEC 中敲低
              相应的一抗：GAPDH、VEGFA、MMP9，4 ℃孵育过                     circ⁃0001649 后，其成管能力和迁移能力均减弱（图
              夜，加入对应二抗，室温孵育 1 h。用 ECL 发光液进                      1C、D、E）。说明 circ⁃0001649 在 hAMSC⁃CM 促血管
              行增强化学发光检测，使用Image Lab软件计算条带                       生成过程中起着重要作用。同时也检测了成血管
              灰度值。                                              相关蛋白，得到的结果一致：hAMSC⁃CM刺激后HU⁃

              1.2.7 RNA提取与实时荧光定量PCR                             VEC细胞内VEGFA和MMP9蛋白表达水平升高，敲
                             ®
                  使 用 TRIzol 提 取 总 RNA 后 ，使 用 Nanodrop          低circ⁃0001649则抑制了蛋白表达（图1F）。
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