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第41卷第6期 胡丽萍，肖轶婧，唐子春，等. 人羊膜间充质干细胞培养上清通过环状RNA⁃0001649/miR⁃203a/VEGFA/
                  2021年6月        MMP9信号通路促进血管生成［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（06）：810-816 ·811                 ·


                HUVECs. Bioinformatic analysis and a series of experiments revealed that circ⁃0001649 could promote the angiogenic and migratory
                ability of hAMSC ⁃ CM on HUVECs by binding miR ⁃ 203a and then reduced the inhibition of miR ⁃ 203a on VEGFA and MMP9.
                Conclusion： The hAMSC⁃CM up⁃regulated circ⁃ 0001649 in HUVECs，which could binding miR⁃ 203a in a ceRNA manner，and
                promoted angiohenesis by increasing VEGFA and MMP9 expression.
               ［Key words］ human amnion⁃derived mesenchymal stem cell（hAMSC）；human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）；angiogenesis
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2021，41（06）：810⁃816］





                    新生血管能够给新生组织提供氧及必要的营                           胶（BD 公司，美国），Image J（1.8.0 版本；http：//im⁃
                养物质，进而在新骨生成过程中发挥重要作用                      ［1-2］ 。  agej.nih.gov/ij/）；Transwell 小室（北京康宁公司）；Li⁃
                研究表明，来自骨髓间充质干细胞条件培养基的外                            pofectamine 2000 转染试剂、TRIzol （Invitrogen 公
                                                                                                   ®
                                                                            ®
                                                   ［3］
                泌体可以通过增强血管生成促进骨再生 。但骨髓                            司，美国），抗 GAPDH、血管内皮生长因子 A（vascu⁃
                间充质干细胞在促进血管新生的广泛应用中受到                             lar endothelial growth factor A，VEGFA）、基质金属蛋
                以下因素的限制：需要一定的侵入性操作，以及供                            白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）单克隆抗
                体年龄依赖性分化导致的不稳定性 。研究表明人                            体（Santa Cruz 公司，美国）。
                                               ［4］
                羊膜源间充质干细胞（human amnion⁃derived mesen⁃             1.2  方法
                chymal stem cell，hAMSC）同样显示了较强的促进血                1.2.1 细胞培养
                             ［5］
                                               ［6］
                管生成的能力 ，具有稳定的活性 ，且采集方便，                               hAMSC 从足月妊娠（健康怀孕女性、妊娠期为
                对供者无风险。与通常用于分离种子细胞的其他                             38~41 周）的女性供者胎盘中分离。本研究所有实
                组织类型相比，捐献的羊膜组织数量丰富，较少产                            验 方 法 均 通 过 南 京 医 科 大 学 伦 理 委 员 会 批 准
                生伦理问题 。因此，hAMSC 是一个具有发展前景                        （PJ2013⁃037⁃001）。本研究涉及的研究均遵循《赫
                          ［7］
                的种子细胞。我们前期研究发现 hAMSC 的培养上                         尔辛基宣言》，招募的每位捐献者对实验条款内容
                                            ［5］
                清具有较强的促血管生成作用 ，然而机制尚不十                            均已知情同意。
                分明确。                                                  细胞贴壁培养于含10%胎牛血清的α⁃MEM培养
                    环状 RNA（circular RNA，circRNA）是一种在真             基中，青、链霉素终浓度为 100 U/mL。HUVEC 贴壁
                核细胞中广泛表达的具有闭合环状结构的长链非                             培养于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中，青、链
                        ［8-10］
                编码 RNA      。研究发现 circRNA 不仅是转录的副                 霉素终浓度为 100 U/mL。细胞均置于 37 ℃含 5%
                产品，还可以在疾病和发展过程中介导细胞增殖、                            CO2的细胞培养箱中培养。
                迁移、侵袭和凋亡        ［11-13］ 。目前发现 circRNA 发挥功         1.2.2 条件培养基的收集
                能的多种机制包括：①circRNA 可充当分子海绵，                            当 hAMSC 在 15 cm 培养皿中生长至 70%~80%
                吸附 miRNA 以减少其对 mRNA 的降解和翻译的                       融合时，去除培养液，并用1× PBS洗涤3次后，换成
                抑制  ［14-16］ ；②部分 circRNA 可调控基因转录        ［17］ ；③   30 mL添加青霉素⁃链霉素（100 U/mL青霉素、100 g/mL
                circRNA可与功能蛋白相互作用           ［18-19］ ；④ circRNA可   链霉素）的 DMEM∶α⁃MEM=1∶1 的混合培养基在含
                被翻译成蛋白      ［13］ 。我们前期研究发现，hAMSC培养                5%CO2的细胞培养箱中培养。24 h后收集30 mL的
                上清（conditioned medium，CM）可促进人脐静脉内皮                培养基，4 ℃离心。然后，培养基经 0.45 μm 过滤器
                细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）   过滤，分装并储存在-80 ℃深低温冰箱作为 CM 使
                内多种circRNA的表达，其中包括circ⁃0001649。因                  用。后续实验使用的 hAMSC⁃CM 含 80% CM，我们

                此，本研究旨在探究 circ⁃0001649 是否参与 hAMSC                 之前的结果表明，这一比例理想地促进了 HUVEC
                促血管生成的作用以及潜在机制。                                   的生存能力。hAMSC 来源于 3 个不同的供体，每个
                                                                  供体的hAMSC⁃CM进行了3次重复实验。采用无血
                1  材料和方法
                                                                  清培养基作为对照。
                1.1  材料                                           1.2.3 血管生成实验
                    胎牛血清、α⁃MEM 培养基、DMEM 培养基（Hy⁃                        将 HUVEC 接种在预先铺有基质胶的 96 孔板
                Clone公司，美国），过滤器（Merck公司，美国），基质                    上（50 μL 每孔，37 ℃ 静置 30 min），接种密度为每
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