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第41卷第6期             陆   敏，卢 伟，杨 勰，等. 人Wnt5a对中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响［J］.
                  2021年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（06）：826-831                       ·827 ·


                    Wnt 蛋白是一个 38~43 kDa 的糖蛋白家族，包                  公司，美国），p⁃PI3K、AKT、p⁃AKT、细胞外信号调节
                含Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8b等19种成员，由单核/                蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/
                巨噬细胞、上皮细胞、牙周膜干细胞等多种细胞分                            2，ERK1/2）、p⁃ERK1/2、丝裂原活化蛋白激酶 1/2
                                             ［1］
                泌，与炎症、肿瘤等多种疾病相关 。根据其激活的                          （mitogen ⁃ activated protein kinase1/2，MEK1/2）、p ⁃
                信号通路，可分为激活经典Wnt信号通路的转化型，                          MEK1/2、PI3K/Akt 抑制剂 LY294002、MEK1/2 抑制
                如 Wnt3a、Wnt7a，以及激活不依赖β⁃catenin 信号通                剂 U0126（Cell Signaling 公司，美国），DAPI（杭州碧
                路的非转化型，如 Wnt4、Wnt11。Wnt5a 属于后者，                   云天公司），兔抗人MPO多抗、Sytox Green核酸染色
                在胚胎发育和细胞生长分化过程中发挥了重要作                             剂（Invitrogen公司，美国）。
                用。炎性刺激能促进Wnt5a的产生。在慢性牙周炎                          1.2  方法
                患者的牙龈组织中，可检测到高表达的Wnt5a，牙周                         1.2.1 人中性粒细胞的分离
                致病菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，                  本研究经南京医科大学伦理委员会批准，所有
                P.gingivalis）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能诱导       纳入研究的志愿者均签署知情同意书。采集健康
                人单核细胞系 THP⁃1 表达 Wnt5a 。但 Wnt5a 在牙                 志愿者外周静脉血 10 mL，密度梯度离心法常规分
                                             ［2］
                                                                                   ［5］
                周炎发生发展中的作用，目前尚不完全明确。                              离获得中性粒细胞 ，流式细胞检测证实，其纯度及
                    中性粒细胞是宿主抵御牙周致病菌入侵的重                           活性均高于90%，可用于后续试验。健康志愿者的
                要防线，能趋化至细菌入侵部位，通过吞噬、脱颗                            纳入标准为：①全身健康，无系统性疾病；②无妊
                粒、呼吸爆发等机制杀灭细菌，其数量过多或活化                            娠、哺乳；③3个月内无感冒、发热等感染性疾病；④
                过度也可能导致功能失调，释放过量活性氧（reac⁃                         3 个月内未服用抗生素、非甾体类抗炎药或免疫抑
                tive oxygen species，ROS）、胶原酶等产物，导致牙周              制剂；⑤无吸烟史。
                软硬组织的破坏 。                                         1.2.2 NET形成的免疫荧光染色与胞外DNA检测
                              ［3］
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                    21 世纪初，Brinkmann 采用佛波酯（phorbol 12⁃                将中性粒细胞以 5×10 个/孔接种于 6 孔板，分
                myristate⁃13⁃acetate，PMA）刺激中性粒细胞，诱导形              为 4 组，空白对照组（A 组）、50 ng/mL Wnt5a 组（B
                成了一种被称为中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil                      组）、1 μg/mL E.coli LPS组（C组）和1 μg/mL P.gingi⁃
                extracellular trap，NET）的结构，后者为细胞向胞外               valis LPS组（D组），每组3个复孔。刺激3 h后，将各
                释放的一种纤维网状染色质结构，富含大量抗菌肽                            组细胞接种于预先涂布聚⁃L⁃赖氨酸的玻片上，采用
                和酶，包括乳铁蛋白、髓过氧化物酶（myeloperoxi⁃                     4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X⁃100透化细胞，随后
                dase，MPO）、弹性蛋白酶等。细菌、病毒、真菌和肿瘤                      加入 1∶250 MPO 抗体，4 ℃孵育过夜，采用 1∶500
                坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）⁃α、白细胞介素           Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG（H+L）二抗
               （interleukin，IL）⁃8等细胞因子均可促进NET的形成，                 37 ℃孵育 2 h，DAPI 染色 2 min，正置荧光显微镜下
                它使死亡的中性粒细胞也能捕获并杀灭微生物 。                            观察NET的形成。
                                                        ［4］
                    作为一种以自分泌或旁分泌方式产生的效应                               为对NET进行定量，将中性粒细胞以5×10 个/孔
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                分子，Wnt5a对NET的形成有何影响，这种影响又将                        接种于 12 孔板，细胞分为 5 组，每组 4 个复孔，A~D
                如何改变牙周炎的发生发展，目前尚不得而知。本                            组刺激同前，2.5 h 后，加入 5 μmol/L DNA 特异性染
                研究拟探讨Wnt5a对NET形成的调控作用及可能机                         料 Sytox Green，避光孵育 30 min，E 组为不添加 Sy⁃
                制，以期进一步阐明Wnt5a对免疫炎症反应的影响。                         tox Green 染料、无刺激的阴性对照组。采用多功能
                                                                  酶标仪 SpectraMaxM2e（MD 公司，德国）检测胞外
                1  材料和方法
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                1.1  材料                                           表示为各组检测值减去阴性对照组检测值的差值。
                    重组人/小鼠 Wnt5a 蛋白（R&D 公司，美国），中                  1.2.3 中性粒细胞呼吸爆发的流式细胞学检测
                性粒细胞分离剂Polymorphprep（AXIS⁃SHIELD公司，                   将中性粒细胞以5×10 个/孔接种于6孔板，A~D
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                挪威），大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）O127：B8          组同 1.2.2，E 组为不添加 DCFH⁃DA 染料、无刺激的
                LPS 和 DCFH⁃DA（Sigma 公司，美国），P.gingivalis           阴性对照组，每组3个复孔。刺激12 h后，各组加入
                ATCC 33277 LPS（InvivoGen 公司，美国），磷脂酰肌              5 μmol/L DCFH⁃DA 荧光探针，37 ℃孵育 40 min，采
                醇三激酶（phosphoinositide 3⁃kinase，PI3K）（Abcam        用流式细胞仪 FACSCalibur（BD 公司，美国）检测
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