Page 50 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第6期
·828 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年6月

488 nm波长下的荧光强度，即产生的ROS水平。结 不加抑制剂、不加 Sytox Green、无刺激的阴性对照
果以刺激组检测值/空白对照组检测值表示。 组。2.5 h 后，检测 NET 形成的胞外 DNA 水平，方
1.2.4 Western blot检测 法同前。
中性粒细胞的分组同 1.2.2，刺激 30 min 后，常 1.3 统计学方法
规裂解细胞，提取总蛋白，SDS⁃PAGE 电泳，转至 采用SPSS10.0软件进行统计学分析，各组数据
PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭 2 h，采用 PI3K、Akt、 间的比较采用单因素方差分析，组间比较采用Dun⁃
MEK1/2、p⁃MEK1/2、ERK1/2、p⁃ERK1/2 抗 体（1∶ nett⁃t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

1 000稀释）和p⁃PI3K、p⁃Akt抗体（1∶500稀释），4 ℃
2 结 果
孵育过夜，加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（1∶
5 000 稀释），孵育 2 h，加入 ECL 化学发光剂，采用 2.1 Wnt5a促进NET的形成
Image Quant LAS 4 000 mini 显影，采用 Image J 图像 免疫荧光染色发现，未刺激的中性粒细胞仅形
分析软件分析各条带灰度值。 成少量胞外DNA网状结构。Wnt5a、P.gingivalis LPS

1.2.5 PI3K/Akt、MEK1/2⁃ERK1/2 对 NET 形成的影 或 E.coli LPS 刺激后，部分中性粒细胞核膜解体，染
响检测 色质解聚，形成胞外 DNA 纤维网状结构，其中 MPO
将中性粒细胞以5×10 个/孔接种于12孔板，分 阳性染色为绿色，DAPI 阳性染色为蓝色，表明 NET
5
为5组，每组4复孔，A~D组加入50 μmol/L PI3K/Akt 形成（图1A）。
抑制剂 LY294002 或 10 μmol/L MEK1/2、ERK1/2 抑 胞外 DNA 的 Sytox Green 荧光染色定量分析显
制剂U0126，预处理30 min后，分别加入空白培养液 示，与空白对照组相比，Wnt5a、P. gingivalis LPS 或
（A 组）、50 ng/mL Wnt5a（B 组）、1 μg/mL E.coli LPS E. coli LPS 刺激后，胞外 DNA 数量明显增多（P <
（C 组）和 1 μg/mL P.gingivalis LPS（D 组）。E 组为 0.05），而各刺激组间无明显差异（P > 0.05，图1B）。
A B
DAPI MPO Merge

空白对照组

*
A B 1 000 * *
Wnt5a组 （ AFU） 800

600
细胞外DNA 400

200
0
LPS组 空白对照组 Wnt5a组
E. coli LPS组
E. coli P. gingivalis LPS组

LPS组

P. gingivalis

A：各组中性粒细胞NET形成的免疫荧光检测（×400）；B：各组胞外DNA的Sytox Green荧光染色定量分析。两组比较，P < 0.05（n=3）。
*
图1 Wnt5a促进NET的形成
Figure 1 Formation of NET stimulated by Wnt5a