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第41卷第6期 朱晓东,许 是,蒋 玫,等. α7烟碱型乙酰胆碱受体基因敲除小鼠牙髓炎模型的构建[J].
2021年6月 南京医科大学学报(自然科学版),2021,41(06):832-837 ·833 ·
α7 烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotine acetylcho⁃ 尾尖,在小鼠无明显运动状况下,将小鼠四肢固定
line receptor,α7 nAChR)作为一种常见的神经递质, 至手术台,用橡皮筋将小鼠的上颌切牙固定,放置
大量存在于神经细胞中,同时α7 nAChR 参与的“胆 到显微镜下,使用金属镊子在下颌切牙处,适当拉
碱能抗炎途径”能够在类风湿关节炎、肺炎、毒血症 开下颌和小鼠舌尖,镜下可清晰观察到上颌第一磨牙
等炎症性疾病中发挥重要抗炎作用 [1-4] 。α7 nAChR 后,用75%的酒精将上颌第一磨牙进行消毒,1/4球钻
受体是乙酰胆碱受体的一个亚型,它是由 5 个相同 在涡轮机低速下磨除牙釉质和部分牙本质,清洗碎
的α亚基组成并具有独特的活化特性和高钙渗透 屑后吹干,使用#20 牙科扩大针进行加压穿刺,形
性,参与了一系列神经、精神和炎症性疾病发生发 成洞孔后,停止操作,开放牙髓腔;对照组 4 只小鼠
展过程 [5-6] 。研究证实,其抗炎作用的关键靶标是炎 仅麻醉,不进行牙髓开放。术后将小鼠置于37 ℃恒
症部位免疫细胞上的α7 nAChR 受体 。研究发现 温板上复苏,待小鼠苏醒后放回原饲养笼。分别在
[7]
大鼠的α7 nAChR基因敲除后,上颌骨软骨及骨髓成 牙髓暴露 1 d、3 d、7 d 麻醉小鼠、心脏灌注后,取上
[8]
骨被抑制 。在人类牙周炎与α7 nAChR 的研究中 颌骨,放入含有多聚甲醛的EP管中进行固定。
发现α7 nAChR 可以降低牙周炎症及减少牙槽骨吸 1.2.3 牙髓组织切片及HE染色
收 。研究发现在小鼠胚胎期的外胚层和成年期牙 上颌骨固定 24~48 h,PBS 冲洗,置于 4%EDTA
[9]
髓中均有α7 nAChR 的表达 [10] 。此外,α7 nAChR 基 中室温下脱钙 3~4 周。将标本脱水,石蜡包埋制备
因敲除鼠在高浓度尼古丁的刺激下,牙槽骨吸收加 5 μm 厚的石蜡切片后,进行脱蜡、水化、苏木素⁃伊
重,细菌含量增加 [11] 。牙髓炎是一种炎症性疾病,α 红染色,脱水、透明、封片后镜下观察,采集图像。
7 nAChR是否也在牙髓炎发生发展的过程中起到抗 1.2.4 免疫组化染色
炎作用,目前尚未见文献报道。因此,本研究拟构建 5 μm石蜡切片,脱蜡、脱水,PBS冲洗;室温下,
α7 nAChR KO小鼠上颌第一磨牙牙髓炎模型,为研究 3% H2O2孵育30 min封闭内源性过氧化物酶,PBS冲
α7 nAChR在牙髓炎发生发展过程中发挥的作用机制 洗;37 ℃孵箱中1 g/L胰蛋白酶消化30 min暴露细胞
提供实验模型。 内抗原,PBS冲洗;10%胎牛血清封闭30 min后滴加
NLRP3(1∶500)一抗,4 ℃过夜,PBS冲洗5 min×3次;
1 材料和方法
滴加山羊抗兔二抗(1∶500),37 ℃避光孵育1 h,PBS
1.1 材料 冲洗;DAB 显色,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲
40 g/L 水合氯醛(分析纯 AR,国药集团有限公 苯透明后中性树胶封片,显微镜下观察NLRP3阳性
司);牙科高速涡轮机(上海通达医疗器械);牙科手 细胞。观察正常和炎症牙髓组织中NLRP3的表达。
机(上海通达医疗器械);#20 牙科扩孔钻(登士柏, 1.3 统计学方法
瑞士);苏木素染色液(北京索莱宝科技有限公司); 本研究测量的指标数据都是以均数±标准差
伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司);正置显微 (x ± s)表示。免疫组化的数据统计采用 Image J 统
镜成像系统(DM4000,徕卡公司,德国);NLRP3 一 计,GraphPad Prism7.0软件进行Two⁃Way ANOVA检
抗(Adipogen 公司,美国);鼠二抗(Thermo Fisher 公 验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。
司,美国)。
2 结 果
1.2 方法
1.2.1 实验动物 2.1 对照组牙髓组织学表现
选取 8~10 周的α7 nAChR KO 雄性小鼠及 WT α7 nAChR KO 鼠与 WT 鼠对照组牙髓组织中
雄性小鼠各16只(来自于南京医科大学动物实验中 (图1),釉质及牙本质完整,高柱状的成牙本质细胞
心范益课题组),12只分为1 d组、3 d组、7 d组进行牙 沿着牙本质排列,梭形状的成纤维细胞在成牙本质
髓炎模型构建实验,4只未处理组作为对照组。本研 细胞层下方,细胞间质均匀染色,无圆形炎症细胞
究经南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准。 形成。NLRP3免疫组化染色结果中提示:在牙髓未
1.2.2 小鼠牙髓炎模型的构建与取材 暴露的情况下,牙髓细胞的胞质中未见阳性结果。
对 12 只 8~10 周的α7 nAChR KO 小鼠及 WT 小 2.2 髓腔开放1 d后的组织学表现
鼠腹腔注射40 g/L水合氯醛,进行术前麻醉,注射量 髓腔开放 1 d,对比正常小鼠的牙髓组织(图
为 10 mL/kg。小鼠深度麻醉后,手指适当按压小鼠 2),α7 nAChR KO 鼠及 WT 鼠第一磨牙的穿髓点处