Page 59 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第8期 熊 亮，胡 寅，王立夫，等. miRNA⁃199a⁃5p在热损伤人皮肤成纤维细胞中的表达及其功能研究［J］.
2021年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（08）：1160-1165 ·1161 ·

P＜0.003］，and the invasion ability of the cells was enhanced［（136.55±6.14）%，P＜0.003］. Conclusion：The expression level of
miRNA⁃199a⁃5p in human skin fibroblasts with thermal injury is positively correlated with cell proliferation，migration and invasion.
Increasing the expression level of miRNA⁃199a⁃5p in thermally injured cells can help it rapid return.
［Key words］ human skin fibroblasts；thermal injury；miRNA⁃199a⁃5p；qRT⁃PCR；cell proliferation；cell migration and invasion
［J Nanjing Med Univ，2021，41（08）：1160⁃1165］

miRNA是一类较短的单链RNA，参与许多靶基 1.2 方法
因的表达与调控，影响细胞生物学功能 ［1-2］ 。miRNA⁃ 1.2.1 细胞培养
199a作为高度保守microRNA，在正常皮肤和肿瘤细 复苏后的HSF常规培养，FBS浓度为10%，胰蛋
胞中表达丰富，影响细胞的增殖和迁移 ［3-4］ 。目前对 白酶消化传代。
miRNA⁃199a⁃5p的研究主要集中在癌细胞 ［5-6］ ，本研 1.2.2 HSF热损伤处理及热损伤模型的制作

究构建人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblasts 细胞生长至80%~90％，胰蛋白酶消化，分成3个
HSF）热损伤模型 ，通过逆转录实时定量 PCR 对 培养皿进行培养：对照组和实验组的培养皿均用封口
［7］
miRNA⁃199a⁃5p 的表达量进行检测，分析热损伤对 膜封好，两个热损伤组在同一温度（52 ℃）水浴中热损
HSF 增殖和迁移功能的影响；用 miRNA⁃199a⁃5p 模 伤不同时间（30 s和60 s），对照组细胞悬液培养皿在
拟物转染热损伤细胞，观察其对热损伤细胞的增殖 37 ℃水浴中水平面下浸泡30 s。细胞均保持在水平
和迁移能力 ，旨在为由热损伤引起的皮肤功能恢 面以下。分别在0 h和24 h进行拍照，并结合瑞⁃姬氏
［8］
复提供研究依据。 染色法观察热损伤对HSF形态的影响。HSF热损伤
模型的制作参照文献［7］：将封口膜密封的培养皿放
1 材料和方法
入52 ℃水浴箱中水平面下浸泡30 s。
1.1 材料 1.2.3 MTT实验
正常 HSF 购自无锡博慧斯生物医药科技有限 将经过热损伤处理的HSF（52 ℃ 30 s）计数，调节
公司。低糖细胞培养液（Dulbecco’s modified Eagle’ 细胞数量至25 000个/mL，每孔200 μL，加入到96孔
s medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine Serum， 培养板中。一组培养 24 h，另一组培养 48 h。培养
FBS）购自美国 Gibco 公司；RNA 提取试剂（TRIzol）、 结束时，每孔分别加入ＭTT 20 μL，2 h后加入DMSO
LipofectamineTM 2000 转染试剂、RT⁃PCR 试剂盒购 溶解，570 nm处测吸光度值。
自 美 国 Invitrogen 公 司 ；microRNA mimics（5′ ⁃ 1.2.4 实时定量PCR
CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCACAGGUAGU ⁃ 将经过热损伤处理的 HSF（52 ℃ 30 s）分为两
CUGAACACUGGGGUU⁃3′）、阴性对照 mimics（5′⁃ 组，一组培养24 h，另一组培养48 h。收集培养皿中
CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCACAGGUAGUC ⁃ 的细胞，用TRIzol 试剂提取细胞miRNA。配制逆转
UGAACACUGGGUU ⁃3′）购自苏州吉玛生物科技有 录及 PCR 扩增体系。逆转录条件为：50 ℃逆转录
限公司；U6 RT 引物（5′⁃CGAGCACAGAATCGCTT⁃ 30 min，94 ℃失活 2 min。PCR 条件为：94 ℃变性
CACGAATTTGCGTGTCAT⁃3′）、miR⁃199a⁃5p RT 引 15 s，60 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 30 s，共 40 个循环后
物（5′⁃GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC⁃ 72 ℃继续延伸10 min。通过2 -△△Ct 法检测miR⁃199a⁃
GCACTGGATACGACGAACAG⁃3′）、U6 扩增引物（正 5p的相对含量。
向引物：5′⁃ CGAGCACAGAATCGCTTCA ⁃3′；反向引 1.2.5 细胞迁移实验

物：5′⁃ CTCGCTTCGGCAGCACATAT⁃3′）、miR⁃199a⁃ 将经过热损伤处理的HSF（52 ℃ 30 s）调节细胞
5p 扩增引物（正向引物：5′⁃GTGCAGGGTCCGAGG⁃ 密度，以过夜铺满为准，接种于6孔板。用100 μL 的
TATT⁃3′；反向引物：5′⁃CTAACCCAGTGTTCAGAC⁃ 枪头在每孔中线轻轻划过，PBS 清洗。用 FBS 浓度
TAC⁃3′）由苏州金唯智公司合成；四甲基偶氮唑盐 为 4%的 DMEM 培养基补充培养液至 3 mL/孔。培

（MTT）试剂盒购自上海碧云天生物公司；Transwell 养24 h后观察细胞的迁移。
小室（康宁公司，美国）；Matrigel（B&D 公司，美国）； 1.2.6 细胞侵袭实验
转染试剂Lipo2000（Invitrogen公司，美国）。 在 Transwell 小室膜的上室面加入稀释后基质