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第41卷第8期 陆好悦，刘聪聪，肇 毅，等. 中药活性成分散沫花素对三阴性乳腺癌细胞抑制作用的初步研究［J］.
2021年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（08）：1166-1172 ·1167 ·
制 TNBC 患者术后复发转移是目前乳腺癌研究领 A （加药） ：具有细胞、CCK⁃8 溶液和药物溶液的孔
域的热点 ［5］ 。散沫花（Lawsonia inermis L.）又称指 的吸光度；A （空白） ：具有培养基和 CCK⁃8 溶液而没有
甲花 ，中药典籍中最早记载于西晋嵇含所著《南方 细胞的孔的吸光度；A （0加药） ：具有细胞、CCK⁃8溶液而
［6］
草木状》，其具有抗肿瘤、抗感染、抗寄生虫等药理 没有药物溶液的孔的吸光度。用 Graphpad Prism 8
功效。散沫花中活性成分散沫花素（lawsone），又称 软件以提取物浓度的对数值 log（X）为横坐标，提取
指甲花醌，有较强的抗肿瘤活性，对包括肺癌、肝 物的吸光度与空白对照吸光度的百分比值为纵坐
癌、肠癌、黑色素瘤及白血病等 ［7-12］ 在内的多种肿瘤均 标，做非线性回归分析，获得抑制细胞增殖的半数
有抑制作用。本研究通过体外实验检测散沫花素对 抑制浓度（IC50 ）。
TNBC细胞的作用，探讨散沫花素治疗TNBC的潜力。 1.2.3 细胞迁移活性检测（划痕实验）
收集预处理后的两组细胞，以每孔 5×10 个细
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1 材料和方法
胞接种于 6 孔板，CO2培养箱培养 24 h，待细胞贴壁
1.1 材料 后用枪头（200 μL）划痕，用PBS 缓冲液洗去漂浮细
散沫花素（2⁃羟基⁃1，4⁃萘醌，分子式：C10H6O3 ） 胞，加入 DMEM 培养基（含 10%胎牛血清），分别于
粉剂（上海 Topscience 生物科技有限公司）；人乳腺 划痕后的0、24 h后在显微镜下拍照，用Image J软件
癌细胞 MDA⁃MB⁃231（ATCC 公司，美国）；人乳腺癌 分析处理前后划痕面积变化，计算抑制迁移率。
细胞SUM1315由Stephen Ethier教授（美国密歇根大 1.2.4 细胞侵袭实验
学）赠予。DMEM 培养基、PBS 缓冲液、胎牛血清、 收集预处理后的两组细胞，用不含胎牛血清的
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0.25％胰酶和青链霉素（Gibco 公司，美国）；CCK⁃8 培养基制备成含4×10 个/mL的细胞悬液加入 Tran⁃
试剂盒（Dojindo 公司，日本）；Transwell 生物膜基质 swell 生物膜基质凝胶包被的侵袭小室（置于 24 孔
凝胶包被的侵袭小室（Costar 公司，美国）；结晶紫、 板 中），Transwell 小室的下层加入含 10%胎牛血清
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物 的培养基，37 ℃培养箱培养 24 h，用棉签擦去孔内
技术有限公司）。 细胞，75%乙醇固定0.5 h后用结晶紫染色1 h，洗去
Thermo 3111 CO2培养箱、MUTiskan GO 酶标仪 多余染液，在显微镜下随机选取5个视野拍照，并计
（Thermo Fisher 公司，美国）；Axiovert 40 CFL 荧光倒 数细胞个数，取 5 个视野的平均数表示肿瘤细胞的
置显微镜（Zeiss 公司，德国）；BD FACSCalibur 流式 体外侵袭数。
细胞仪（BD Bioscience 公司，美国）。 1.2.5 平板克隆形成实验
1.2 方法 收集预处理后的两组细胞，以500个/孔均匀接
1.2.1 细胞培养与分组 种至 6 孔板上，培育 14 d 后用 70%乙醇固定 3 min，
用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养MDA⁃ 1%结晶紫染色15 min，PBS洗涤2次并拍照。
MB⁃231 和 SUM1315 细胞。功能实验分组：①散沫 1.2.6 EdU实验检测癌细胞DNA合成能力
花素处理组：MDA⁃MB⁃231 和 SUM1315 细胞分别用 收集预处理后的两组细胞，以 2 000 个/孔均匀
含有200 μmol/L、150 μmol/L散沫花素的DMEM 培养 接种至96孔板中。按 EdU 试剂盒配制染色液和进
基预处理 24 h 后收集细胞培养；②对照组：含 0.1% 行实验操作，结束后置于显微镜下观察并拍照。
DMSO的DMEM培养基预处理24 h后收集细胞。 1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期变化
1.2.2 抑制增殖活性检测（CCK⁃8法） 收集预处理后的两组细胞，以每孔 5×10 个细胞
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在 96 孔板中接种对数生长期的 MDA⁃MB⁃231 接种至 6 孔板，以不含 EDTA 的胰蛋白酶使细胞脱
和SUM1315细胞，每孔接种约2 000个，待细胞贴壁 壁，收集细胞，按细胞周期试剂盒中说明进行实验
后加入不同浓度散沫花素DMEM 培养基（含10%胎 操作，用流式细胞仪进行细胞周期检测。
牛血清），以含 0.1% DMSO 的 DMEM 培养基（含 1.3 统计学方法
10%胎牛血清）为空白对照。在处理72 h后，吸除旧 应用 SPSS22.0 和 Graphpad5.0 软件对实验数据
培养基，加入 10 μL 的 CCK⁃8 及 90 μL 无血清培养 进行分析。所有定量数据以均数±标准差（x ± s）表
基，放入CO2培养箱静置2 h后，用酶标仪读取450 nm 示，两组比较采用 t 检验，多组间比较采用方差分
吸光度。按照下列公式计算细胞活力： 析，两两比较采用 SNK 法。P < 0.05 为差异有统计
细胞活力=［A （加药） -A （空白） ］/［A （0加药） -A （空白） ］×100% 学意义。
