Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第5期
·606 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年5月

表1 目的基因以及内参引物序列 胞出现大量的透亮空泡，呈现典型的脂滴形态，提
Table 1 RT⁃qPCR primers of target genes and primers 示出现明显的脂肪积累（图2A）。此外，通过反转录
基因 引物（5′→3′）
⁃ 聚 合 酶 链 反 应（reverse transcription ⁃ polymerase
36B4⁃F（Mouse） CACTGGTCTAGGACCCGAGAAG
chain reaction，RT⁃PCR）检测分化标志分子过氧化
36B4⁃R（Mouse） GGTGCCTCTGGAGATTTTCG
物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferator acti⁃
PPARγ⁃F（Mouse） CACAATGCCATCAGGTTTGG
vated receptor gamma，PPARγ）、过氧化物酶体增殖
PPARγ⁃R（Mouse） GCTGGTCGATATCACTGGAGATC
PGC⁃1α⁃F（Mouse） AAGTGTFFAACTCTCTGGAACTG 激活受体共激活因子 1（peroxisome proliferative acti⁃
PGC⁃1α⁃R（Mouse） GGGTTATCTTGGTTFFCTTTATG vated receptor，gamma，coactivator 1 alpha，PGC⁃1α）、
Plin1⁃F（Mouse） GGTGAGCGGGACCTGTGA 脂滴包被蛋白 1（perilipin 1，Plin1）、细胞死亡诱导
Plin1⁃R（Mouse） TTCTCATAGGCATTGCACACAGA DFFA 样效应物 c（cell death⁃inducing DFFA⁃like ef⁃
FSP27⁃F（Mouse） AAGCGCATCGTGAAGGAGAT fector c，FSP27）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，
FSP27⁃R（Mouse） GGTGCCAAGCAGCATGTG FAS）、脂联素（adiponectin）的 mRNA 水平明显上调
Adiponectin⁃F（Mouse） TCACGGTGTACATGAAAGATGTG
（图2B），这些结果提示SVF细胞已经成功分化为成
Adiponectin⁃R（Mouse） GAGAACGGCCTTGTCCTTCT
熟脂肪细胞，可用于下一步实验。
CD36⁃F（Mouse） TTAGATGTGGAACCCATAACTGGA
2.3 成熟脂肪细胞与Hepa1⁃6共培养提高肝细胞甘
CD36⁃R（Mouse） TTGACCAATATGTTGACCTGCAG
油三酯水平
FATP2⁃F（Mouse） GATGCCGTGTCCGTCTTTTAC
FATP2⁃R（Mouse） GACTTCAGACCTCCACGACTC 经分化6 d，SVF已成为成熟脂肪细胞。预先将
ACC⁃F（Mouse） TGGACAGACTGATCGCAGAGAAAG Hepa1⁃6种入Transwell小室，使之有足够时间贴壁，
ACC⁃R（Mouse） TGGAGAGCCCCACACACA 并在贴壁 24 h 时，达到细胞密度 50%左右。如图 3
FAS⁃F（Mouse） GCTGCGGAAACTTCAGGAAAT 所示，使成熟脂肪细胞与 Hepa1⁃6 进行间接接触无
FAS⁃R（Mouse） AGAGACGTGTCACTCCTGGACTT 血清共培养 48 h（图 3A）以及对照培养 48 h（图
GPAT1⁃F（Mouse） CAACACCATCCCCGACATC
3B）。培养完毕后，PBS洗涤2遍，收集Hepa1⁃6细胞
GPAT1⁃R（Mouse） GTGACCTTCGATTATGCGATCA
进行进一步测定。分别使用普利莱组织细胞甘油
SREBP1c⁃F（Mouse） GGAGCCATGGATTGCACATT
三酯和总胆固醇试剂盒测定细胞甘油三酯和总胆
SREBP1c⁃R（Mouse） GGCCCGGGAAGTCACTGT
SCD1⁃F（Mouse） CCGGAGACCCCTTAGATCGA 固醇水平。相较于对照组，进行过Transwell 共培养
SCD1⁃R（Mouse） TAGCCTGTAAAAGATTTCTGCAAACC 的Hepa1⁃6细胞甘油三酯水平显著增加（P < 0.001，
PPARα⁃F（Mouse） ACAAGGCCTCAGGGTACCA 图 3C），而总胆固醇水平无明显变化（图 3D），表明
PPARα⁃R（Mouse） GCCGAAAGAAGCCCTTACAG 两种细胞间接接触共培养已成功实现，成熟SVF 细
ACOX1⁃F（Mouse） TCCAGACTTCCAACATGAGGA 胞能够诱导Hepa1⁃6细胞脂质堆积增加。
ACOX1⁃R（Mouse） CTGGGCGTAGGTGCCAATTA
2.4 Transwell共培养后的Hepa1⁃6细胞脂代谢通路
MTTP⁃F（Mouse） CCTACCAGGCCCAACAAGAC
关键基因变化
MTTP⁃R（Mouse） CGCTCAATTTTGCATGTATCC
通过 Transwell 与成熟 SVF 细胞共培养能够增
（含有 0.5 μg/mL 胰岛素的 DMEM/F12 完全培养基） 加Hepa1⁃6细胞的脂质积累，提示Hepa1⁃6脂代谢通
处理SVF 细胞2 d以进一步增加脂质积累。使用普 路可能发生变化。应用RT⁃qPCR检测Hepa1⁃6细胞
通倒置光学显微镜观察SVF 细胞形态，发现与分化 脂代谢通路关键基因 CD36 分子（CD36 molecule，
第0天相比，经分化液Ⅰ、Ⅱ诱导分化6 d后，SVF细 CD36）、脂肪酸转运蛋白 2（fatty acid transport pro⁃

A B C
A：培养24 h；B：培养48 h；C：培养72 h。
图1 SVF细胞提取后培养24 h、48 h和72 h细胞形态（×100）
Figure 1 Morphology of SVF cells after 24 h，48 h or 72 h cultured（×100）