Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第5期
               ·604 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年5月


                  随着生活水平的提高，肥胖作为一种全球性流                          （SYBR Green qPCR Master Mix，南京诺唯赞公司）；
              行病，已逐渐成为人们不容忽视的健康问题                    ［1-3］ 。肥   0.4 μm Transwell 小室（跨细胞小室）以及细胞培养
              胖是由于能量的摄入超过消耗所导致的能量过剩，                            皿、细胞培养孔板（Corning 公司，美国）；70 μm 滤器
              造成脂肪组织过度扩增引起。由于脂肪组织扩增                             （Fisherbrand公司，美国）；组织细胞甘油三酯测定试
                                        ［4］
              能力有限，无法有效储存脂质 ，同时伴随脂肪组织                           剂盒（北京普利莱公司）；总胆固醇测试盒（南京建成
              分泌功能的渐进紊乱，诱导产生大量的促炎抗炎因                            生物工程研究所）；反转录试剂盒（TaKaRa 公司，日
              子、趋化因子、生长因子等 。脂质的溢出以及这些                           本）；引物由上海捷瑞基因有限公司合成；C57BL/6J
                                     ［5］
              脂肪因子循环浓度的升高可诱导全身慢性炎症和                             小鼠（南京大学模式动物研究所）；生物安全柜、CO2
              胰岛素抵抗等代谢紊乱，从而导致一系列包括非酒                            细胞培养箱（Thermo 公司，美国）；普通倒置光学显
              精性脂肪肝等肥胖相关并发症              ［4，6-8］ 。肥胖诱导非酒        微镜（Olympus 公司，美国）；LightCycler480 型 Real⁃
              精性脂肪肝发生的分子机制，一方面在于因能量进                            time PCR仪（Roche公司，瑞士）。
              一步失衡，所引起的脂质从循环中溢出，并随后在                            1.2  方法
              非脂肪组织（如肝脏）中堆积的现象，即发生异位脂                           1.2.1 小鼠SVF细胞提取
              肪储存 ；另一方面，脂肪以及肝脏都具有内分泌的                                4~6 周 C57BL/6J 雄性小鼠（动物试验伦理编号
                    ［9］
              功能  ［10-11］ ，二者之间也存在相应的激素调节           ［12］ ，以上    IACUC⁃1601170⁃4），脱颈处死后，在超净工作台中
              两方面共同构成脂肪⁃肝脏交流               ［13］ 。探讨病理条件         取出小鼠皮下脂肪（白色脂肪），在 PBS 中漂洗沥干
              下的脂肪⁃肝脏交流机制，有利于进一步理解肥胖导                           后，放入 2 mL 离心管中，加入 1.5 倍胶原酶，用无菌
              致非酒精性脂肪肝的病理生理机制。因此，寻找到                            剪刀将组织剪成 1 mm 小块。离心管封口后放入
                                                                                     3
              能够有效研究脂肪—肝脏交流的模型已刻不容                              37 ℃水浴锅消化1 h，每5 min颠倒混匀1次。待细胞
              缓。脂肪组织血管基质部分（stromal vascular fratc⁃              被消化成乳糜状时取出，于超净工作台中用70 μm筛
              tion，SVF）在体内不仅具有强大的抗炎、免疫调节和                       网过滤。取滤液于20 ℃，1 500 r/min，离心10 min，弃
              修复作用，还具有参与血管生成以及干细胞储存等                            上清。使用 PBS 重悬洗涤，重复上述离心条件得到
              功能  ［14-15］ ，其含有丰富的、可塑性极强的脂肪组织来                   含 SVF 细胞沉淀。在生物安全柜中，使用 DMEM/
              源的间充质干细胞（adipose tissue⁃derived mesenchy⁃         F12 完全培养基（DMEM/F12 90%，澳洲胎牛血清
              mal stem cells，ASC），具有体外分化为成熟脂肪细胞                 10%，三抗1%）重悬细胞后，种入6孔板中，置于5%
              的潜能    ［16］ 。小鼠肝癌细胞（mouse hepatocarcinoma         CO2培养箱中培养，每2 d换1次液。
              cells，Hepa1⁃6）是一种常用的鼠源肝癌细胞系，能够                    1.2.2 小鼠SVF细胞分化
              响应外界刺激并发生变化。                                           生长至100%的SVF细胞，接触抑制2 d后              ［17］ ，加
                  本研究致力于构建适合研究成熟脂肪细胞与                           入分化液Ⅰ（含有 5 μmol/L 地塞米松，0.5 μg/mL 胰
              肝细胞交流的细胞模型，通过选用原代提取培养                             岛素，0.5 mmol/L 3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤，1 μmol/L
              SVF细胞，在体外进行成熟分化后，与Hepa1⁃6细胞                       罗格列酮的DMEM/F12完全培养基）。2 d后换分化
              进行共培养，观察脂肪细胞对肝细胞的影响，从而                            液Ⅰ。第4天加入分化液Ⅱ（含有 0.5 μg/mL胰岛素
              为研究两种细胞间的相互作用提供可靠的脂肪细                             的DMEM/F12完全培养基），第6天镜下可见明显脂
              胞⁃肝细胞共培养模型，在细胞层面提供一种研究脂                           滴分化，即为成熟脂肪细胞。
              肪⁃肝脏交流的可能。                                        1.2.3 Transwell共培养方式的建立
                                                                     0.4 μm 共培养小室能够允许上下层细胞的细
              1  材料和方法
                                                                胞因子、营养物质等自由通过，而细胞无法从中通
              1.1  材料                                           过，从而达到使 2 种细胞间接接触培养的目的。将
                  DMEM/F12 培养基、DMEM/H+培养基、胎牛血                   Hepa1⁃6细胞种入0.4 μm小室，在DMEM/H+完全培
              清、胰蛋白酶（Gibco 公司，美国）；磷酸缓冲盐溶液                       养基中生长 1 d，待终密度达到 50%时，使用 PBS 洗
             （武汉赛维尔）；Ⅰ型胶原酶（Sigma⁃Aldrich 公司，美                   涤小室，将其置入已使用 PBS 洗涤 2 遍后的分化成

              国）；TRIzol Reagent 总 RNA 提取剂、胰岛素（Invitro⁃          熟的脂肪细胞上，并更换使用无血清 DMEM/F12 培
              gen 公司，美国）；3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤、地塞米                      养基培养 48 h，收集 Hepa1⁃6 细胞进行下一步检
              松、罗格列酮（MCE 公司，美国）；SYBR Green Ⅰ                    测。采用同时种入小室但不与成熟脂肪细胞共培
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