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第42卷第5期          王雨竹，张 许，李 仲. 成熟SVFs细胞与Hepa1⁃6细胞共培养模型的建立及对肝细胞脂
                  2022年5月               代谢的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（05）：603-609                   ·605 ·


                养的 Hepa1⁃6 细胞作为对照，培养条件为无血清                        DEPC处理过的ddH2O溶解30 min 即可。使用 Nana⁃
                DMEM/F12培养基。                                      Drop 微量核酸测定仪对所得 RNA 进行定量及纯度
                                                                      ［18］
                1.2.4  Hepa1⁃6细胞甘油三酯水平及总胆固醇水平                     分析 。
                检测                                                    第一步去除基因组DNA（genomic DNA，gDNA），
                    按照每 1×10 个细胞加入100 μL细胞裂解液，混                   加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，
                               6
                匀后室温静置10 min充分裂解细胞。所得裂解物，                         Total RNA 1 μg，RNase Free ddH2O 加 至 10 μL，
                取一半于 70 ℃加热 10 min，完毕后进行涡旋混匀。                     42 ℃ 5 min 完成第一步反应。第二步为逆转录反
                20 ℃ 2 000 g 离心 10 min 后，取上清液进行酶学测                应，向第一步反应液（10 μL），添加 PrimeScript RT
                定。另一半于4 ℃ 16 000 g离心30 min后，进行蛋白                  Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×Prime⁃
                浓度测定。酶学测定方法：按照试剂盒 A 液和 B 液                        Script Buffer 2（for real time）4 μL，RNase Free ddH2O
                4∶1 的比例配制反应液，每孔 10 μL 上清液加入                       4 μL，配成共计 20 μL 的反应体系，37 ℃15 min，
                190 μL 反应液。于 37 ℃反应 15 min，550 nm 酶标              85 ℃ 5 s完成逆转录。逆转录cDNA保存于-20 ℃。
                仪读数，依照标准曲线计算甘油三酯含量。标准曲                                使用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative
                线绘制方法：使用ddH2O，将4 mmol/L甘油标准品倍                     real⁃time PCR）测定 SVF 分化标志物以及 Hepa1⁃6
                比稀释为 1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 μmol/L，       脂代谢通路变化。将 cDNA 稀释 5 倍后使用。取
                与酶学样本同时测定即可。蛋白浓度测定方法：取                            稀释后 cDNA 1 μL，SYBRGreen I 5 μL，上游引物
                蛋白测定样本稀释 50 倍后进行测定。将蛋白浓度                         （1 μmol/L）2 μL，下游引物（1 μmol/L）2 μL 混匀后，
                测定试剂盒A液和B液以1∶1混合即得反应液。取                           放入LightCycler480型Real⁃time PCR 仪进行实时荧
                10 μL 稀释后的蛋白样本加入 100 μL 反应液，于                     光PCR反应。反应程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃，15 s，
                37 ℃反应 30 min，562 nm 酶标仪读数，依照标准曲                  60 ℃ 60 s，40 个循环，95 ℃ 10 s，60 ℃ continuous，
                线计算蛋白浓度。标准曲线绘制方法：使用ddH2O，                         40 ℃ 20 min。引物序列见表1。
                将 0.5 mg/mL 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，          1.3  统计学方法
                BSA）标准品倍比稀释为 0.500 0、0.250 0、0.125 0、                 所有实验重复 3 遍，用 Graphpad Prism 软件对
                0.062 5、0 mg/mL，与蛋白样本同时测定即可。使用蛋                   实验数据进行统计学处理及作图，结果以均值±标
                白浓度校正甘油三酯含量。                                      准误（x ± sx ）表示。使用两独立样本 t 检验分析结
                    使用生理盐水收集细胞，超声破碎后，取2.5 μL                      果，P < 0.05 为差异有统计学意义。
                清液（无需离心）添加 250 μL 反应液，于 37 ℃反应
                                                                  2  结 果
                10 min，510 nm酶标仪读数，依照标准曲线计算总胆
                固醇含量。标准曲线绘制方法：使用ddH2O，将5.17                       2.1 SVF细胞单纯培养在倒置显微镜下呈现梭形
                mmol/L 胆固醇标准品倍比稀释为 2.59、1.29、0.65、                    在 DMEM/F12 完全培养基中，通过原代提取的
                0.32、0.16、0.08 μmol/L，与样本同时测定即可。蛋白                SVF细胞，大部分24 h即可贴壁，呈现灰色团状未伸
                浓度测定方法同甘油三酯测定。使用蛋白浓度校                             展的状态（图1A）。同时，视野里可见较多无法贴壁
                正总胆固醇含量。                                          的杂细胞，需在次日进行连续换液以及 PBS 洗涤得
                1.2.5 RNA提取及相对定量水平检测                              以除去。培养 48 h，细胞逐渐伸展开，呈现梭形、多
                    6 孔板加入 1 mL TRIzol，使用无菌无酶枪头刮                  角形（图 1B），表明 SVF 已成功提取。培养 72 h 后，
                下裂解细胞，置于无菌无酶离心管内。向离心管加                            SVF细胞完全伸展开，形态变得饱满（图1C）。此后
                入 200 μL 氯仿，剧烈上下颠倒振荡 30 s。室温静置                    经3~5 d，SVF细胞密度可达100%，呈现紧密接触抑
                5 min 后，取上清液转移至新的无菌无酶离心管内。                        制的状态。
                加入与上清液等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀，                           2.2 SVF细胞经诱导分化6 d后成为成熟脂肪细胞
                室温静置15 min。4 ℃ 10 000 g离心 15 min，取白色                  当SVF 细胞接触抑制 2 d 后，首先使用分化液
                沉淀加入 1 mL 已预冷的 75%乙醇，焦碳酸二乙酯                       Ⅰ（含有 5 μmol/L 地塞米松，0.5 μg/mL 胰岛素，
               （diethylpyrocarbonate，DEPC）水 配 制 ，颠 倒 洗 涤 。        0.5 mmol/L 3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤，1 μmol/L 罗格
                4 ℃ 10 000 g 离心 10 min，弃上清，再次空离离心                 列酮的 DMEM/F12 完全培养基）处理 SVF 细胞 4 d，
                管。吸去残留乙醇，白色沉淀即为 RNA。加入                            以诱导 SVF 向成脂方向分化。之后使用分化液Ⅱ
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