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第42卷第6期       刘子勤，李文文，吴敬珍，等. Liguzinediol调控心肌细胞线粒体动力学和自噬改善心肌梗死后大鼠
                  2022年6月              心功能的机制［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（06）：769-779                   ·771 ·


                冷却后-20 ℃保存备用。配制12%分离胶，按30 μg                      1.2.10 JC⁃1线粒体膜电位试剂盒检测
                上样量进行上样，同时加入 5 μL 蛋白 Marker，于恒                        细胞接种于底部放有 12 mm 圆形玻片的 24 孔
                压 80~100 V 电泳。PVDF 膜浸于甲醇活化 15 s，于                 板中，待细胞密度生长至80%左右加入JC⁃1荧光探
                低温环境下转膜。转膜条件：恒压100 V，1.5 h。转                      针，孵育30 min后给药（方法同1.2.6）。
                膜完成后，用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，经TBST充分                       1.3  统计学方法
                洗涤后（5 min/次、5 次），与相应目的蛋白（MFN1、                        彩用 SPSS 21.0 统计软件，计量资料以均数±标
                DRP1、FUNDC1、LC3Ⅰ/Ⅱ、P62、GAPDH抗体）结合，                准差（x ± s）表示，对多组数据进行单因素方差分析，
                4 ℃过夜。TBST充分洗涤后（5 min/次、5次），与相应                   重复测量数据进行重复测量方差分析，两两比较采
                二 抗 室 温 结 合 2 h，TBST 充 分 漂 洗（5 min/ 次 、           用LSD⁃t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                5 次），滴加ECL发光液，于成像系统中曝光。
                                                                  2  结 果
                1.2.6  氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）
                模型构建、分组及给药                                        2.1  Lig对心肌梗死模型大鼠心功能的影响
                    为模拟心肌缺血状态，选用OGD模型。使用氯                             超声心动图结果显示（图1），相较于假手术组，
                化钴诱导缺氧，MTT法检测不同浓度氯化钴和Lig对                         模型组大鼠的 EF 和 FS 均显著下降，表明心肌梗死
                H9C2细胞活力的影响，与对照组相比，培养24 h后                        模型大鼠的心脏功能显著降低。给予Dig和不同剂
                H9C2细胞存活率50%的氯化钴浓度为600 μmol/L，                    量的 Lig 治疗的大鼠，相较于模型组，EF 和 FS 明显
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                依据前期实验，选择 Lig 最高浓度为 100 μmol/L               ，    升高，LVVOLs 和 LVIDs 减小，超声结果显示 Lig 可
                此时细胞存活率为100%；MTT法检测600 μmol/L氯                    改善左室收缩功能从而改善心脏泵血。
                化钴+无糖培养基在不同时间点对 H9C2 细胞活力                         2.2  Lig 对心肌梗死模型大鼠心肌损伤标志物的
                的影响，与对照组相比，培养12 h后H9C2细胞存活                        影响
                率为 50%；因此选择 600 μmol/L 氯化钴+无糖培养                       可根据大鼠血清中 BNP、LDH 含量判断心肌损
                基培养12 h复制H9C2细胞OGD模型。Western blot                 伤的严重程度，通过ELISA试剂盒对BNP、LDH含量
                检测 HIF⁃1α表达升高验证模型复制成功。细胞密                         进行检测，分析结果发现模型组大鼠血清BNP、LDH
                度生长至80%左右给药，分为空白对照组、模型组、                          水平较假手术组显著升高（图 2）。与模型组相比，
                Lig（100 μmol/L Lig）组、Lig+Rapa（100 μmol/L Lig+     Dig组、Lig 10 mg/kg和Lig 20 mg/kg组可显著降低血
                20 μmol/L Rapa）组 、Lig+3⁃MA（100 μmol/L Lig+        清BNP、LDH水平，说明Lig可显著改善大鼠左冠状
                10 mmol/L 3⁃MA）组。提前加入 Lig、Rapa、3⁃MA 预             动脉前降支结扎所致的心脏损伤。
                处理2 h，OGD处理12 h后收集细胞样本。                           2.3 Lig对心肌梗死模型大鼠心肌组织中ATP含量的
                1.2.7  转染 Ad⁃mCherry⁃GFP⁃LC3B 检测 H9C2 细胞          影响
                自噬溶酶体形成                                               通过试剂盒检测心肌组织中 ATP 含量（图 3），
                    细胞接种于底部放有 12 mm 圆形玻片的 24 孔                    结果显示：与假手术组相比，模型组 ATP 含量显著
                板中，待细胞密度达到50%时进行转染，MOI值=10，                       降低；与模型组相比，Lig（10 mg/kg、20 mg/kg）组
                每孔加入 10 μL 转染试剂，轻轻晃动混匀后放入培                        ATP含量明显升高。
                养箱培养 24 h 后更换培养液。待细胞密度生长至                         2.4  Lig 对心肌梗死模型大鼠心肌和线粒体形态的
                80%左右进行给药（方法同1.2.6）。                              影响
                1.2.8 荧光探针检测H9C2细胞ROS水平                               HE 染色观察心肌形态，通过电镜进一步探寻
                    细胞接种于底部放有 12 mm 圆形玻片的 24 孔                    心肌细胞中线粒体形态结构的变化，结果显示（图
                板中，待细胞密度生长至80%左右加入ROS荧光探                          4）：光镜下，假手术组大鼠心肌排列紧密，未观察到
                针，孵育30 min。进行药物处理后镜下观察拍照（方                        心肌断裂、细胞间隙变大，模型组大鼠可见心肌断
                法同1.2.6）。                                         裂，细胞间隙增大，给予 Dig 和不同剂量 Lig 治疗组
                1.2.9 TUNEL试剂盒检测细胞凋亡                              大鼠心肌断裂不同程度减少，间隙变窄。电镜下，
                    细胞接种于底部放有 12 mm 圆形玻片的 24 孔                    假手术组大鼠心肌线粒体呈圆形和椭圆形，嵴结构
                板中，待细胞密度生长至80%左右给药。固定细胞                           致密，规律分布于肌原纤维之间，肌原纤维排列整
                后按试剂盒说明书进行处理（方法同1.2.6）。                           齐连续，可见清晰的横纹，有自噬体形成；模型组大
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