Page 18 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
·770 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年6月
激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PTNK1）一抗 期容积（left ventricular volume in diastole，LVVOLd）、
（批号：20200521）、E3 泛素⁃蛋白连接酶（ubiguitin⁃ 左心室收缩期容积（left ventricular volume in systole，
protein ligase E3，Parkin）一 抗（批 号 ：20200424）、 LVVOLs）、左心室舒张期内径（left ventricular inter⁃
Bcl2/腺病毒 E1B 相互作用蛋白 3（BCL2/adenovirus nal diameter in diastole，LVIDd）、左心室收缩期内径
E1B 19 kDa protein⁃interaction protein 3，BNIP3）一抗 （left ventricular internal diameter in systole，LVIDs）
（批号：20200101）（成都正能生物）。大鼠脑钠肽 等。检测结束后颈总动脉取血，静置后离心取上层
（brain natriuretic peptides，BNP）ELISA 检测试剂盒 血清-80 ℃保存备用。每组取6个血清样本，使用试
（批号：201912）、大鼠乳酸脱氢酶（lactate dehydroge⁃ 剂盒对血清中BNP、LDH含量进行检测。
nase，LDH）ELISA 检测试剂盒（批号：201912）（武汉 1.2.3 检测大鼠心肌组织中ATP含量
酶免公司）；大鼠胚胎心肌细胞（H9C2）（批号： 每组取 6 只大鼠的心脏样本，每个样本剪取
20210706，南京凯基生物）；雷帕霉素（rapamycin， 50 mg，加入 300 μL RIPA 裂解液（含 1%PMSF）研磨
Rapa，批号：202111⁃1 mg）、3⁃MA（批号：202111⁃ 裂解，4 ℃ 3 000 r/min 离心取上清，按照试剂盒说
® 明书步骤进行加样，操作结束后放入酶标仪中检
100 mg）（上海 Dcchemical 公司）；TOROBlue qRT
Premix with gDNA Eraser2.0（批号：k2109221）、TO⁃ 测 638 nm 处吸光度值，再用 BCA 法检测蛋白浓
ROGreen qPCR Master Mix（批号：k2108181）（南通 度，按照说明书计算公式代入数值计算样品中
®
Toroivd公司）；Ad⁃mCherry⁃GFP⁃LC3B（批号：C3011⁃ ATP 含量。
1 mL）、ROS检测试剂盒（批号：011570200504）、JC⁃1 1.2.4 大鼠心肌电镜检测、HE 染色、免疫组织化学
线粒体膜电位试剂盒（批号：08281900421）（杭州碧 染色
云天公司）。 颈动脉取血后摘取大鼠心脏，生理盐水灌洗，横
1.2 方法 向切取心尖部 3 mm 厚组织，用 2.5%戊二醛固定后
1.2.1 模型复制、分组及给药 电镜检测线粒体形态（放大倍数×10 000），横向切
7~8 周龄、雄性 SD 大鼠称重，1%戊巴比妥钠 取结扎点水平 3 mm 厚组织，用 4%多聚甲醛固定
30 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定四肢头部，四肢 后制作石蜡切片。剩余心脏于-80 ℃和 4%多聚甲
皮下连接心电图电极，监测心电图，气管插管连 醛中保存备用。
接小动物呼吸机（呼吸频率：90 次/min，潮气量 HE 染色：石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色
10~12 mL，呼吸比为1∶2）。左前胸备皮，碘伏消毒， 4 min，自来水洗 2 min；1%盐酸酒精分化 20 s（镜下
于胸骨左侧第3~4肋间切开长约1 cm 切口，钝性分 控制），自来水洗 15 min，蒸馏水洗 1 min；伊红染色
离肌肉、胸膜，用止血钳撑开第三肋间，放入扩创器 6 min，自来水洗 5 min；脱水透明后中性树脂封片，
固定切口以暴露手术视野，弯头镊轻轻撕开心包 显微镜400倍观察、拍照。
膜，使用 6/0 带线缝合针在左心耳下缘 3~4 mm 进 免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡至水，抗原
针，进针深约 1.5 mm，斜向右上肺动脉圆锥方向出 修复处理后用 5%BSA 孵育 20 min；分别与一抗
针，针距约3~4 mm，结扎左冠状动脉前降支，观察结 （PINK1、Parkin、BNIP3、FUNDC1）4 ℃ 孵 育 过 夜 ；
扎后大鼠心电图 J 点上移确认心肌梗死，随后逐层 37 ℃复温，用 PBS 漂洗 3 次后与二抗 37 ℃孵育 1 h。
缝合切口。将造模后的大鼠随机分为模型组（生理 PBS 漂洗后用 DAB 染色，苏木素对细胞核进行染
盐水 6 mL/kg，n=10）、Dig 组（0.033 2 mg/kg，n=10）、 色，脱水透明封片后镜下拍照。
Lig组（Lig 5.0、10.0、20.0 mg/kg，n=10）、假手术组（大 1.2.5 Western blot检测心肌组织和H9C2细胞自噬
鼠开胸但不结扎）。手术当天，开始灌胃给药，每日 和动力学相关蛋白表达
1次，持续12周。假手术组灌胃等体积生理盐水。本 剪取左心室组织50 mg，加入500 μL RIPA裂解
研究已通过南京中医药大学实验动物伦理委员会审 液（RIPA∶PMSF=100∶1），于冰浴中用电动匀浆器充
查（201906A030）。 分破碎裂解组织后离心（4 ℃、12 000 g、15 min），收
1.2.2 大鼠心功能检测 集上清。细胞给药处理后，消化收集细胞，每皿细
给药12周后，检测左心功能。每组取4只大鼠 胞加入80 μL RIPA裂解液，充分吹打使细胞裂解，离
采用 B 超检测射血分数（ejection fraction，EF）、左室 心取上清。BCA法检测蛋白浓度，按上样缓冲液∶蛋
短轴缩短率（fractional shortening，FS）、左心室舒张 白上清=1∶4 加入 5×上样缓冲液，沸水浴煮 15 min，
