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第42卷第6期              金瑶瑶，赵伟华，高 钰，等. 小鼠脊髓损伤后Bmi⁃1在脊髓中的表达变化［J］.
                  2022年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（06）：780-789                       ·781 ·


                    脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）可由跌落、交            板内皮细胞黏附分子 1（platelet and endothelial cell
                通事故、脊髓缺血或肿瘤等引起               ［1-2］ 。SCI 患者常面      adhesion molecule ⁃ 1，PECAM ⁃ 1/yCD31）抗 体（BD
                临瘫痪、感觉障碍、神经性疼痛等系列问题，给个                            Pharmingen 公司，美国），单克隆小鼠抗 Bmi ⁃1 抗体
                                           ［3］
                人、家庭和社会带来沉重负担 。研究者始终致力                           （Abgent 公司，美国）。Alex Fluor 594 标记驴抗小鼠
                于探索药物、不同术式、干细胞与生物材料移植、电                           IgG、Alex Fluor 488 标记驴抗大鼠 IgG、Alex Fluor
                生理与功能锻炼、智能假肢等多种方法治疗SCI，但                          488 标记驴抗兔 IgG（Jackson ImmunoResearch 公司，
                至今临床尚缺乏行之有效的治疗途径                 ［4-5］ 。因此，进      美国），DAPI（sigma 公司，美国），多克隆兔抗 PCNA
                一步探索SCI后的病理生理改变及相关机制显得极                           抗体（Proteintech公司，美国），HRP标记的单克隆小
                为重要。                                              鼠抗 GAPDH 抗体（Proteintech 公司，美国），羊抗小

                    B 淋巴瘤 Mo⁃MLV 插入区 1（B lymphoma Mo⁃             鼠 IgG⁃HRP、羊抗兔 IgG⁃HRP（KPL 公司，美国）。
                MLV insertion region 1，Bmi⁃1）是多梳抑制蛋白复合            BCA 蛋白检测试剂盒（Bio⁃Rad 公司，加拿大），ECL
                物1（polycomb repressive complex 1，PRC1）的重要成        免疫印迹检测试剂盒（Amersham Pharmacia公司，美
                员之一   ［6-7］ ，可调节细胞增殖、生长、DNA 修复、凋亡                 国）。
                和衰老   ［8-9］ 。既往研究显示，自胚胎发育起至成年，                        LISA脊髓损伤造模仪（美国Norton 神经科学研
                Bmi⁃1 在广泛脑区与脊髓中均有表达              ［10］ 。Bmi⁃1 敲    究中心Dr. Shields馈赠）、冰冻切片机（Thermo Fisher
                除小鼠（Bmi⁃1 KO）可存活 1~2 个月，在 2~4 周时出                 公司，美国）、正置荧光显微镜及图像采集系统（Leica
                现共济失调，小脑颗粒层与浦肯野氏细胞减少，海马                           公司，美国）、蛋白电泳仪及成像系统（Bio⁃Rad公司，
                                                          ［11］
                神经元退行性变，胼胝体区星形胶质细胞增生等 。                           美国）。
                本课题组前期结果显示 Bmi⁃1 在脑发育、脑功能及                        1.2  方法
                脑衰老中均有重要作用           ［12］ 。但Bmi⁃1在脊髓损伤后           1.2.1 动物手术
                病理进程中的表达变化及作用尚未见报道。                                   小鼠采用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）
                    因此，本研究利用 LISA 脊髓损伤造模仪制作                       麻醉，固定于 LISA 小鼠固定支架，行 T9 椎板切除
                T9 脊髓中度钝挫伤模型小鼠，采用 Western blot 及                  术。手术组采用LISA脊髓损伤造模仪制作T9脊髓
                免疫荧光染色观察 Bmi⁃1 在 SCI 后不同时间点的表                     中度钝性撞击模型，损伤深度 0.6 mm              ［13］ ；假手术组
                达及细胞定位，初步探索 Bmi⁃1 在脊髓损伤后病理                        只行 T9 椎板切除术。分层缝合肌肉与皮肤。术后
                进程中的表达变化。                                         动物置 30 ℃加热垫苏醒恢复，每天两次膀胱护理，
                                                                  至膀胱排尿功能恢复后行术后常规护理与喂养。
                1  材料和方法
                                                                  1.2.2 组织取材与切片
                1.1  材料                                               动物手术后将手术组小鼠随机分为 5 组，每组
                1.1.1 动物及动物分组                                     10 只。分别于术后 1、3、7、14、28 d 采用 1％戊巴比
                    实验用8~10周龄雌性C57Bl/6小鼠共60只，动                    妥钠麻醉小鼠，其中每组6只小鼠经左心室4％多聚
                物随机分为两组：对照组（即假手术组，n=10）和手                         甲醛灌注后，取距损伤中心头尾侧各5 mm范围内脊
                术组（n=50）。小鼠饲养、管理及使用均严格按照南                         髓组织，继行 4％多聚甲醛固定，梯度浓度蔗糖脱
                京 医 科 大 学 实 验 动 物 管 理 规 范 进 行（IACUC：              水，OTC包埋后行冠状位冰冻切片，片厚10 μm；4只
                1809007）。                                         经左心室生理盐水灌注后，取距损伤中心头尾侧各
                1.1.2 试剂和仪器                                       5 mm 范围内脊髓组织，用于提取蛋白行 Western

                    单克隆兔抗神经元核心抗原（neuronal nuclei                  blot检测。假手术组10只，于椎板切除术后28 d时，
                antigen，NeuN）抗体（Abcam 公司，美国），单克隆大                 同上取6只行4％多聚甲醛灌注取材，4只行生理盐
                鼠抗髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗体              水灌注取材。
               （Millipore公司，美国），多克隆兔抗神经胶质纤维酸                      1.2.3 免疫荧光染色
                性 蛋 白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗 体        冰冻切片经 37 ℃ 30 min 烘干后，常规 PBS 洗
               （Millipore公司，美国），多克隆兔抗离子钙接头蛋白                      涤，用含0.1％Triton X⁃100的10％驴血清和0.5％牛
                分子 1（ionized calcium binding adapter molecule 1，  血清白蛋白（BSA）室温封闭 1 h。一抗为单克隆兔
                Iba⁃1）抗体（Wako 公司，日本），单克隆大鼠抗血小                     抗 NeuN 抗体（1∶1 000）、单克隆大鼠抗 MBP 抗体
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