Page 58 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
·810 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年6月
(brown adipose tissue,BAT)、白色脂肪组织(主要是 70 Hz,120~180 s,按说明书抽提 RNA,OneDrop 微
附 睾 白 色 脂 肪 ,epididymal white adipose tissue, 量分光光度计进行定量及纯度分析。
eWAT)和米色脂肪组织(主要是腹股沟脂肪组织, 用5×HiScript Ⅱ qRT Super Mix逆转录为 cDNA,
inguinal white adipose tissue,iWAT) 。BAT 主要由 -20 ℃保存。
[6]
棕色脂肪细胞组成,含有丰富的血管和高度神经支 用去离子水 10 倍稀释 cDNA,实时荧光定量
配,是机体非战栗性产热的主要器官 ;eWAT 的主 PCR 按照稀释后的cDNA 4.6 μL,SYBR Green 5 μL,
[7]
要功能是储存和释放能量,血管和神经分布最少; 上、下游引物(10 mmol/L)各 0.2 μL,混匀,反应在
iWAT 在腹股沟区较为明显,交感神经纤维相对 ThermoFisher Quant Studio5荧光定量PCR仪上进行,
[8]
BAT 较少 。iWAT 中除脂肪细胞外还存在一些免 反应程序为:预变性 95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃
[9]
疫细胞,比如嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等 。iWAT 30 s,40 个循环;熔解曲线:95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min,
响应寒冷和其他某些刺激而出现适应性改变,称为 95 ℃ 15 s。以 2 -ΔΔCT 计算目的基因相对表达量。
[11]
适应性产热 [6,10] ,这一过程伴随着神经重塑 。在肥 目的基因和内参引物如下:解偶联蛋白 1(un⁃
胖个体中,脂肪组织呈现出慢性、低度炎症的状态,其 coupling protein 1,Ucp⁃1)上游引物 5′⁃AGGCTTC⁃
中巨噬细胞呈现出促炎性M1型极化的状态 [12] 。冷 CAGTACCATTAGGT⁃3′,下游引物 5′⁃CTGAGTGAG⁃
刺激后 iWAT 中嗜酸性粒细胞、巨噬细胞被选择性 GCAAAGCTGATTT⁃3′;细胞死亡诱导 DNA 片段化
激活,选择性激活的巨噬细胞可以通过分泌儿茶酚 因子样效应子 A(cell death inducing DFFA like effec⁃
胺增加脂解、促进适应性产热 [13] 。与 BAT 相比, tor A,Cidea)上游引物 5′⁃TGCTCTTCTGTATCGCC⁃
iWAT 具有更大的表型灵活性,可以根据外界环境 CAGT ⁃ 3′ ,下 游 引 物 5′ ⁃ GCCGTGTTAAGGAATCT⁃
调整产热或脂质储存表型。BAT和iWAT能够增加 GCTG⁃3′;过氧化物酶体增殖受体γ共激活因子 1α
能量消耗、促进产热,有益于探究肥胖及其相关代 (peroxisome proliferator⁃activated receptor gamma co⁃
谢综合征的治疗。 activator 1⁃α,Ppargc1α)上游引物 5′⁃AGCCGTGAC⁃
本研究通过观察C57BL/6J小鼠3种脂肪组织对 CACTGACAACGAG⁃3′,下游引物 5′⁃GCTGCATG⁃
冷刺激响应的区别,为研究冷刺激条件下脂肪组织 GTTCTGAGTGCTAAG⁃3′;内 参 基 因β⁃actin上游引
功能及作用机制提供基础。 物 5′⁃GTTGGTTGGAGCAAACATC⁃3′,下游引物 5′⁃
CTTATTTCATGGATACTTGGAATG⁃3′。
1 材料和方法
1.2.3 Western blot
1.1 材料 各脂肪组织加裂解液后匀浆,冰上充分裂解
10 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠购于南京医科大学 后,4 ℃ 12 000 g 离心 10 min,转移上清至新 EP 管
医药实验动物中心,体重24~28 g,实验动物的饲养、 中。加入5×SDS上样缓冲液,变性后电泳,转膜,室
使用和操作均获得南京医科大学医药实验动物中心 温封闭1 h,一抗过夜,孵育二抗,ECL化学发光法检
伦理委员会批准(伦理审批号为 IACUC⁃1901036)。 测蛋白表达。
蛋白 marker(ThermoFisher 公司,美国),逆转录试 1.2.4 流式细胞术
剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司),SYBR 脂肪组织用消化酶消化,细胞过筛,离心后重
Green(上海翌圣生物科技股份有限公司),引物由 悬 1 次,再次离心,Fc 受体封闭液封闭,加入相应抗
苏州金唯智生物科技有限公司合成。 体 anti⁃CD45⁃PE/Cy7、anti⁃CD11b⁃PerCP/Cy5.5、anti⁃
1.2 方法 F4/80⁃AF488、anti⁃CD11c⁃APC,孵育 30 min。流式
1.2.1 动物分组和处理 细胞染色缓冲液洗涤,细胞活性染料染色。离心去
将小鼠适应性喂养 1 周,待小鼠体征稳定后随 染料,重悬细胞,加入固定剂,室温下避光孵育。洗
机分为 2 组:对照组和冷刺激组。对照组小鼠喂养 涤后离心弃上清,重悬细胞。加入破膜剂和 anti⁃
于室温(22 ℃)环境;冷刺激组小鼠于6 ℃环境饲养, CD206⁃PE,避光孵育后洗涤,离心弃上清,再涡旋使
两组均单笼单只。 细胞完全重悬,用 0.1%甲醛固定,2~8 ℃避光保存,
1.2.2 RNA提取及相对定量分析 并在24 h内对固定的细胞进行分析。
取 20~30 mg 小鼠脂肪组织,加 500 μL RNA⁃ 1.3 统计学方法
easy Isolation Reagent 在高速组织研磨仪中研磨, 所有数据均使用 Excel 进行统计学分析。定量