Page 63 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 63

第42卷第7期              吴 迪，王 萍，雷       晨，等. 负载抗菌多肽温敏水凝胶的制备及性能研究［J］.
                  2022年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：957-964                        ·959 ·


                scope，SEM）观察水凝胶的内部结构和形貌特征。                        油组和 HA/HPMC/甘油⁃FP 组。将小鼠用 1%戊巴
                将最佳配比下的 HA/HPMC/甘油水凝胶放在 37 ℃                      比妥钠腹腔麻醉后，背部脱毛、温生理盐水冲洗、
                的水浴锅中使其凝胶化，随后进行冷冻、干燥、喷金                           拭干，碘酊消毒，在小鼠背部剪去直径约 1 cm 的
                处理，并在加速电压为5 kV的条件下观察水凝胶横                          全层皮肤，制备创伤模型。将 100 μL 溶于生理盐
                截面的形态结构。                                          水 中 的 E. coli（1×10 CFU/mL）接 种 于 皮 肤 创 口
                                                                                      6
                1.2.6  细胞毒性检测                                     上。感染 1 d 后，取对照组及各实验组溶液 200 μL
                    将 0.05%（W/V）FP 包载到最佳配比下的 HA/                  置于背部创面，分别于创伤后的第 0、5、10、15 天观
                HPMC/甘油体系中，得到HA/HPMC/甘油⁃FP温敏水                     察并记录创面愈合面积及愈合时间，根据以下公式
                凝胶，取 1 mL 最佳配比下的 HA/HPMC/甘油水凝胶                    计算创伤愈合率，并评估创面愈合速度。创面愈
                和 HA/HPMC/甘油⁃FP 水凝胶分别加到 10 mL 含有                  合率=（初始创面面积-创面愈合后面积）/初始创面
                10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基                         面积 × 100%。
                中，37 ℃孵育 24 h 得到水凝胶浸提液。将 L929 以                   1.3  统计学方法
                1×10 个/mL的密度接种到96孔板中，在含有体积分                           使用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计分析，
                    4
                数5% CO2的37 ℃培养箱中培养12 h至细胞完全贴                      计量数据以均数±标准差（x ± s）表示，采用单因素方

                壁。吸弃各组培养基，实验组分别加入 HA/HPMC/                        差分析对多组间样本均数进行比较，P < 0.05 为差
                甘油水凝胶浸提液和 HA/HPMC/甘油⁃FP 水凝胶浸                      异有统计学意义。
                提液，对照组加入DMEM完全培养基，每组设置6个
                                                                  2 结    果
                平行孔。在第 1、3、5 天时取出培养板，每孔加入
                10 μL CCK⁃8 溶液（CCK⁃8 试剂盒，Dojindo 公司，日             2.1  水凝胶的Tgel及凝胶时间检测
                本），37 ℃避光孵育2 h。用酶标仪在450 nm波长下                         制备含有不同含量 HA 和甘油的水凝胶体系，
                测量吸光度。                                            采用试管倒置法研究HA/HPMC/甘油体系的相转变
                1.2.7  体外抗菌性能测试                                   行为，评估并选择溶胶⁃凝胶转变温度为 37 ℃左右
                    细菌生长曲线：取 1×10 CFU/mL 的大肠杆菌                   （人体生理温度）的最佳配比水凝胶。如表 1 所示，
                                          6
               （Escherichia coli，E. coli）悬液150 μL加至试管中，同          随着甘油含量的增加，溶液的 Tgel显著下降，并且含
                时分别加入 150 μL Luria⁃Bertani（LB）液体培养基               有 2% HA 的水凝胶组 Tgel 低于含有 1% HA 的水凝
               （对照组）以及最佳配比下的HA/HPMC/甘油水凝胶                         胶组。甘油含量低于 20%的样品，其 Tgel均在 40 ℃
                和 HA/HPMC/甘油⁃FP 水凝胶，充分混匀后在 37 ℃                   以上，远高于体温，HA2/HPMC7/甘油 25组为 29 ℃，在
                下以100 r/min的转速下共培养48 h，并分别于0、2、                   室温下即可发生凝胶化，不利于注射给药。尽管
                4、8、12、24、48 h 时用酶标仪测定各组在 600 nm 波                HA1/HPMC7/甘油 20 组的 Tgel 为 39 ℃，接近体温，但
                长处的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，培养时间                            HA1/HPMC7/甘油 25和 HA2/HPMC7/甘油 20组则更理想
                为横坐标，绘制各组E. coli的生长曲线。                            为 35 ℃。考虑到 HA2/HPMC7/甘油 20的凝胶时间要
                    活/死细菌染色：各取200 μL最佳配比下的HA/                     短于 HA1/HPMC7/甘油 25，最终选择了 HA2/HPMC7/甘
                HPMC/甘油水凝胶和 HA/HPMC/甘油⁃FP 水凝胶加                    油 20组为最佳配比。如图1所示，HA2/HPMC7/甘油 20
                入24孔板中，在37 ℃无菌培养箱中使其凝胶化，各                         水凝胶在常温下为可流动的溶液状，而在加热到

                                                      6
                组水凝胶分别加入 200 μL 浓度为 1.0×10 CFU/mL                 37 ℃后则转变为不可流动的凝胶。
                的E. coli悬液，在37 ℃下共培养24 h，对照组为含有                   2.2  流变性能检测
                LB 液体培养基的 E. coli 悬液。24 h 后，实验组和对                     为了验证水凝胶内部的溶胶⁃凝胶相转变行为，

                照组分别加入LIVE/DEAD BacLight染色液（Invitrogen            通过流变仪检测了HA2/HPMC7/甘油 20水凝胶黏弹性
                公司，美国），避光孵育 15 min 后，通过激光共聚焦                      参数随温度的变化。从图 2 中可以看出，在温度升
                显微镜观察荧光图像，并计算各处理组死细菌和活                            高的初始阶段，该体系的 G′和 G″都较低，且 G′曲线
                细菌的荧光强度。                                          低于G″，随着温度升高，G′的增长明显快于G″，并在
                1.2.8  小鼠皮肤创面愈合率的检测                               33 ℃左右超过 G″。G′和 G″的交点对应的温度即为
                    将 Balb/c 小鼠随机分为 3 组，每组 5 只，分别                 溶胶⁃凝胶相转变温度，表明此时水凝胶从溶胶状态
                为对照组（PBS 溶液）、最佳配比下的 HA/HPMC/甘                     转变为凝胶状态。
   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68