Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第8期
               ·1066 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年8月


                  细菌是导致感染性疾病的最常见病因。近年来，                         组草图，并对该菌的耐药基因、毒力基因、菌株序列
              由于抗生素滥用带来的选择压力，加速了致病菌对抗                           型进行了全面的分析。
              生素产生耐药性 ，临床分离到的多耐药菌及全耐药
                            ［1］
                                                                1  材料和方法
              菌的菌株数量急剧攀升。抗生素耐药性（AMR）细
              菌严重威胁人类的生命健康，给社会经济造成沉                             1.1  材料
              重负担 。临床常见的耐药菌有大肠杆菌（E.coli）、                            大肠杆菌 MG1655 菌株由实验室保存，J2_5 菌
                    ［2］
              肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜                           株分离自南京医科大学第一附属医院患者的临床
              绿假单胞菌等，其中在革兰阴性杆菌中，大肠杆菌耐                           样本，该菌株为 ESBL（+）菌，对多种抗生素产生耐
              药问题最为严重。尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是泌                         药。研究已通过南京医科大学伦理审核［批准文号
              尿道感染的主要致病菌 ，可引起败血症和新生儿脑                           是：南医大伦审（2021）478 号］。所有菌株均在
                                  ［3］
                          ［4］
              膜炎等并发症 ，大肠杆菌是导致新生儿侵袭性全身                           Luria⁃Bertani（LB）培养基中于 37 ℃培养。
                                       ［5］
              感染的三大常见致病菌之一 。大肠杆菌对多种抗                                 酵母抽提物（Oxiod 公司，英国），氯化钠（北京
              生素呈交叉耐药，是全世界迄今为止报告的耐药率最                           中国国药集团），胰蛋白胨（Oxiod 公司，英国），琼脂
                          ［6］
              高的细菌之一 ，其导致的临床感染治疗难度大。                            粉（上海生工），2×Taq PCR Master Mix、琼脂糖（上海
                  针对β⁃内酰胺类抗生素耐药的大肠杆菌在临床                         翊圣），恒温培养振荡器（上海智城），PCR 扩增仪
              上最常见。β⁃内酰胺类抗生素是目前临床使用率很                           （Eppendorf，德国），琼脂糖水平电泳仪（北京六一生
                                                      ［7］
              高的抗生素，占抗生素总使用量的 30%~40% 。β⁃                       物），凝胶成像仪（伯乐公司，美国）。
              内酰胺类药物的作用机制是通过抑制细菌细胞壁                             1.2  方法
              黏肽合酶的产生，阻止黏肽的产生，进而破坏细菌                            1.2.1 J2_5菌株基因组测序
              的细胞壁 。产生超广谱β⁃内酰胺酶（ESBL）的大                              J2_5 的基因组 DNA 用 TIANamp Bacteria DNA
                       ［8］
                                                         ［9］
              肠杆菌菌株对多种β⁃内酰胺类药物具有耐药性 ，                           Kit（Tiangen Biotech）提取，并使用 Illumina HiSeq 技
              常见的 ESBL 编码基因包括 CTX⁃M、SHV、TEM             ［10］ 。  术进行测序。使用ABySS v2.0.2拼接软件对序列进
              在过去 10 年中，TEM 和 SHV 型是最常见的 β⁃内酰                   行拼接，使用 GapCloser v1.12 软件对组装结果进行
              胺酶基因类型，但近年来，CTX⁃M 型在世界范围内                         局部填充和碱基校正。基因预测由 GeneMarkS
              广泛传播    ［11］ 。与对β⁃内酰胺类敏感的大肠杆菌感染                   v4.6b 软件进行，将预测基因的蛋白序列分别与 Nr、
              相比，ESBL 大肠杆菌感染的临床治疗效果更差 。                         Genes、eggNOG 和GO数据库进行blast比对，从而获
                                                         ［12］
              从2003年到2018年，在全球范围内，社区中ESBL大                      得预测基因的注释信息。
              肠杆菌的肠道携带率增加了8倍 。因此，需要新的                           1.2.2 系统发育分析
                                          ［13］
              治疗方法和公共卫生策略来预防ESBL大肠杆菌的                                使用 MLST Finder 2.0 用于多位点序列分型
                                                                       ［18］
              传播扩散。                                             （MLST） ，对来自 16 个大肠杆菌的 7 个管家基因
                  耐药的致病性大肠杆菌还携带多种毒力因子                           （adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA 和 recA）检索并导出
             （细菌定植相关基因、黏附素、毒素、铁获取因子、脂                           序列，使用 MEGA7.0软件进行多序列比对、整理、对
              多糖、侵袭素等），通常毒力基因可由致病岛（PAI）、                        齐，再使用邻接算法构建系统发育分析树，用 Boot⁃
              质粒和其他可移动遗传元件编码                ［14］ 。对致病性大         strap重复抽样1 000次验证。
              肠杆菌的传播动力学和毒性克隆选择的机制仍然                             1.2.3 细菌耐药基因与毒力基因预测
              知之甚少，因此对其耐药分子及毒力基因的研究具                                 为预测大肠杆菌 J2_5 菌株中的耐药基因和毒
              有重要的流行病学意义。                                       力基因，使用毒力因子数据库（VFDB）（网址：http：//
                  目前，全基因组测序在公共卫生关注的病原体                          www.mgc.ac.cn/cgi ⁃ bin/VFs/v5/main.cgi?func=VFana⁃
              监测中已经广泛应用          ［15］ 。通过全基因组测序可以               lyzer）检测其毒力基因，使用抗生素耐药性综合数据
              监测流行病学进展，同时可以检测新基因型大肠杆                            库（CARD）（网 址 ：https：//card.mcmaster.ca/analyze/
              菌的毒力基因和耐药基因             ［16-17］ 。因此，本研究使用         rgi）确定大肠杆菌J2_5菌株基因组序列中的抗生素
              Illumina HiSeq 平台对一株新分离的临床多重耐药                    抗性基因。
              的 ESBL 大肠杆菌 J2_5 进行高通量测序，利用生物                     1.2.4 原噬菌体预测与分析
              信息学工具进行数据拼接、注释和分析，获得基因                                 使 用 Prophage Hunter 网 络 服 务 器（网 址 ：
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