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第42卷第9期
               ·1236 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年9月


                  肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E.coli，            目的基因合成并导入PUC57质粒中，该质粒的构建
              EHEC）是一种常见的食源性致病微生物，主要引起                          由上海生工生物工程股份有限公司完成。以同样
              食源性疾病      ［1- 3］ 。EHEC 中主要的致病血清型是                的方法构建其他常见的肠道致病菌（金黄色葡萄球
              O157：H7，是 1975 年从 1 例出血性结肠炎患者中分                   菌、沙门氏杆菌、弯曲菌、耶尔森菌、志贺杆菌）质粒
              离出来的，最早在1982年美国的俄勒冈州和密歇根                          模板。
              州暴发流行 。由EHEC O157：H7引起的症状主要                       1.2.2 引物探针合成
                        ［4］
              是非出血性腹泻       ［5-6］ ，严重的可发展为溶血性尿毒症                     引物和探针根据RAA引物和探针设计原则，在
              综合征   ［7-8］ 、出血性结肠炎、血栓性血小板减少性紫癜                   构建好的重组质粒内运用 Primer Premier 5 在该扩
                              ［9］
              和永久性器官衰竭 。目前世界上很多国家中，仍有                           增片段上分别设计2条上游引物、5条下游引物和1条
                                                       ［10］
              不少人缺乏干净的饮水和基本医疗卫生保障 ，由                            探 针 ，利 用 NCBI 网 站（https：//www.ncbi.nlm.nih.
              EHEC O157：H7造成的感染仍会对大众健康造成威                       gov/）的 Primer⁃BLAST 验证引物和探针的特异性。
              胁，近两年不时有EHEC感染的报道               ［11-12］ 。早期发现     所有引物和探针（表1）均由上海生工生物技术有限
              是应对 EHEC O157：H7 传播的最佳策略之一，可以                     公司合成，并采用高效液相色谱法（high perfor⁃
              及时控制感染者，遏制其暴发流行。因此，快速检                            mance liquid chromatography，HPLC）进行纯化。
              测可以在这个阶段发挥关键作用，检测方法的研究
                                                                 表1 RAA荧光检测EHEC O157：H7的引物和探针核酸序列
              具有重要意义。
                                                                 Table 1  Sequences of primers and probe for fluorescent
                  之 前 常 用 的 检 测 EHEC O157：H7 的 方 法 为                     RAA assay for EHEC O157：H7
              PCR 和脉冲场凝胶电泳等           ［13-14］ 。这些方法准确性           引物/探针                 序列（5′→3′）
              较高，在实验室应用普遍，然而，它们都需要精密
                                                                 E⁃F1    ACAGGATTTGTTAACAGGACAAAYAATGTT
              的设备和训练有素的人员，成本较高，应用场景                              E⁃F2    TTCACATGTTACCTTTCCAGGTACAASAGCG
              有限。在条件有限的情况下，需要一种操作简便、                             E⁃R1    CCAGACGAAATTCTCTCTGTATTTGCCTGAA
              省时省力的检测方法，从而早发现早治疗，为疾病                             E⁃R2    TCATCGTATAAACAGGAGCAGTTTCAGACAG
              防控赢取时间。重组酶介导的恒温扩增（recombi⁃                         E⁃R3    CTGATTCTCCCCCAGTTCAGAGTGAGGTCCAC
              nase⁃aided amplification，RAA）技术具有检测时间              E⁃R4    CCATCCTCTCCCCGATACTCCGGAAGCACATT
                                                                 E⁃R5    AGTATCGCTGATATATTATTAAAGGATATT
              短、操作简便等优点          ［15-16］ ，所以本研究基于此方法
                                                                 E⁃probe  CAGAGATGCATCCAGAGCAGTTCTGCGTTT/
              建立了 EHEC O157：H7 的快速 RAA 荧光法和 RAA
                                                                         i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/CACTGTTACAGCAGA
              试纸条法（RAA⁃lateral flow dipstick，RAA⁃LFD），旨在                 （C3⁃spacer）
              为基层等特殊环境提供简便的筛查EHEC O157：H7
              的方法。                                              1.2.3 RAA荧光方法的建立
                                                                     RAA 荧光法最佳引物的筛选：以含有 EHEC
              1  材料和方法
                                                                O157：H7 DNA序列的质粒作为模板，将设计的2条上
              1.1  材料                                           游引物、5条下游引物进行2×5组合，结合探针，并与
                  MiniBEST 质粒纯化试剂盒（TaKaRa 公司，日                  RAA 荧光核酸扩增试剂盒中的其他试剂混合为
              本）；RAA核酸扩增试剂盒（荧光法）、RAA核酸扩增                        50 μL 的扩增体系。将反应体系置于B⁃6100 RAA 恒
              试剂盒（试纸条法）、胶体金侧向流免疫层析试纸                            温振荡离心仪中震荡混匀2 min，转移至F⁃1620恒温
              条、B⁃6100 RAA 恒温振荡离心仪、F⁃1620 恒温核酸                  核酸扩增检测仪，39 ℃反应16 min，每20 s采集1次
              扩增检测仪（江苏奇天基因生物科技有限公司）；                            荧光值。挑选出起峰时间最早、峰值最高的上下游引
              -20 ℃冰箱（青岛 Haier 公司）；Eppendorf 移液器                物组合作为最佳引物。
             （Eppendorf公司，德国）。                                       RAA荧光法引物浓度和探针浓度优化：在50 μL

              1.2  方法                                           扩增体系中分别加入1.5、1.8、2.1、2.4、2.7 μL原始浓
              1.2.1 重组质粒构建                                      度为10 μmol/L的最佳上下游引物进行扩增，以浓度
                                                                       6
                  从 GeneBank 数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/gen⁃      为1×10 拷贝数/μL的EHEC O157：H7质粒为模板进
              bank）中获得 EHEC O157：H7 保守基因 Stx Ⅰ和 Stx             行荧光RAA核酸扩增，筛选出最佳引物浓度。在扩
              Ⅱ的核酸序列，寻找相对保守区域，挑选 480 bp 的                       增体系中分别加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL 原始浓
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