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第42卷第9期 蔡 欣，王源林，赵 杰，等. 重组酶介导的肠出血性大肠杆菌O157：H7等温扩增方法的建立［J］.
2022年9月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（09）：1235-1239，1252 ·1237 ·

度为 10 μmol/L 的探针进行扩增，以浓度为 1×10 拷 E⁃F1+E⁃R2 E⁃F2+E⁃R1 E⁃F2+E⁃R2
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E⁃F2+E⁃R3 E⁃F2+E⁃R4
贝数/μL 质粒为模板进行荧光 RAA 法扩增，筛选出
最佳探针浓度。 20 000
1.2.4 RAA⁃LFD法的建立 15 000
在RAA荧光法优化的条件下，将荧光法优化好 （ mV ）
的引物和探针序列设计成 LFD 法的引物和探针。 10 000
将设计好的引物探针按照 RAA 荧光法的 50 μL 体 荧光值
系配置反应管，将反应管置于 B⁃6100 RAA 恒温振 5 000
荡离心仪中震荡混匀2 min后，设置反应温度39 ℃，
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反应时间16 min。反应结束后的扩增产物通过胶体 0 2 4 6 8 10 12 14 16
金侧向流免疫层析试纸条检测。从反应管中取 时间（min）
图1 EHEC O157：H7引物筛选
5 μL扩增产物，与95 μL PBS缓冲液在1.5 mL EP管
Figure 1 Primer screening for EHEC O157：H7
中混匀，将试纸条的偶联垫末端垂直插入EP管中，使
其接触混合液，2 min 后取出试纸条观察并拍照记录 时扩增曲线效果最佳。同样，探针体积为 1.0 μL
结果（阳性样品出现红色检测线和蓝色质控线，阴性 时，扩增效果最佳（图2B）。
样品不出现红色检测线仅出现蓝色质控线）。 2.2 RAA⁃LFD法的建立
1.2.5 灵敏性实验 利用荧光法筛选好的引物和探针更改荧光标记
以 EHEC O157：H7 质粒为模板进行灵敏性评 的位置，设计出RAA⁃LFD法的引物和探针（表2）。
价。将构建质粒按浓度梯度 10 倍倍比稀释成 1× 2.3 灵敏性实验
10 ~1×10 拷贝数/μL阳性标准品备用。利用优化好 RAA 荧光法灵敏性实验结果（图3A）显示，16 min
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的两个 RAA 反应扩增体系依次对上述定量样品进 左右1×10 ~1×10 拷贝数的样本均有扩增曲线出现，
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行测定，确定方法的检出限。 1×10 ~1×10 拷贝数样本和阴性对照无扩增曲线，由
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1.2.6 特异性实验 此得出最低检出限为1×10 拷贝数。RAA⁃LFD法的
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采用与消化道感染相关或者临床症状相近的 灵敏性检测结果（图3B）显示，16 min左右1×10 ~1×
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细菌质粒样本进行特异性评价。以5种在人群中较 10 拷贝数出现红色检测线，1×10 ~1×10 拷贝数及
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为常见的肠道细菌如金黄色葡萄球菌、沙门氏杆 阴性对照仅出现蓝色质控线，RAA⁃LFD法最低检出
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菌、弯曲菌、耶尔森菌、志贺杆菌及 EHEC O157：H7 限为1×10 拷贝数。说明EHEC O157：H7 RAA荧光
质粒为模板同时进行检测，评价EHEC O157：H7 RAA 法及RAA⁃LFD法均具有较好的灵敏性。
荧光法和RAA⁃LFD法的特异性。 2.4 特异性试验
RAA荧光法检测结果（图4A）显示，只有EHEC
2 结 果
O157：H7 出现光滑的扩增曲线，为阳性扩增，其他
2.1 EHEC O157：H7 RAA 扩增体系的建立 样本如金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、弯曲菌、耶尔
2.1.1 引物、探针筛选 森菌、志贺杆菌及阴性对照均没有扩增，均为阴
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以浓度为 1×10 拷贝数/μL 的 EHEC O157：H7 性。RAA⁃LFD法显示（图4B），只有EHEC O157：H7
质粒为模板，进行 RAA 荧光实验，筛选出最佳上下 出现红色检测线，为阳性，其他样本及阴性对照仅
游引物E⁃F2、E⁃R2，扩增曲线如图1所示（未扩增的 出现蓝色质控线，均为阴性结果。表明本研究建立
引物组合及每组的阴性对照未显示），E⁃F2、E⁃R2引 的 RAA 荧光法和 RAA⁃LFD 法特异性较高，不会发
物对在4 min 内即开始起峰，在16 min内达到峰值， 生交叉反应。
表明最佳引物组合为E⁃F2、E⁃R2。
3 讨 论
2.1.2 引物和探针浓度的优化
根据2.1.1实验得出的最佳引物组合，以浓度为 本研究结合 RAA 技术建立 EHEC O157：H7 的
1×10 拷贝数/μL质粒为模板，ddH2O为阴性对照，将 两种快速检测方法，操作简便，无须特殊学习和培
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浓度为10 μmol/L的E⁃F2、E⁃R2引物设置5个梯度加 训，与普通聚合酶链式反应（polymerase chain reac⁃
样量进行RAA荧光检测（图2A），引物体积为1.5 μL tion，PCR）、荧光定量 PCR 技术相比，无需高温条件